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rhLEDGFp52基因原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化         
rhLEDGFp52基因原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化
作者:赵海生  … 文章来源:第三军医大学西南眼科医院 重庆400038 点击数: 更新时间:2006-7-7 14:22:24
目的 构建rhLEDGF p52 基因原核表达载体,获得rhLEDGF p52蛋白。 方法 1利用基因重组技术将rhLEDGF p52 基因构建于原核表达载体pET30a(+)中,经酶切、测序鉴定构建结果。 2通过入终浓度为0.1mmol/ L、0.5mmol/ L、1mmol/ L、2mmol/ L、4mmol/ L的IPTG诱导30min 、1h、2h、3h、4h、5h、6h、24h,使其在大肠杆菌 BL21(DE3)中获得最佳表达。 3利用1:1000LEDGF抗体对rhLEDGF p52进行免疫蛋白印迹试验,鉴定诱导表达蛋白的特异性。 4通过Ni-NTA His.Bind.Resin方法进行纯化,以10 mmol/ L、50 mmol/ L、100 mmol/ L和150 mmol/ L终浓度的梯度咪唑洗脱液洗脱目的蛋白,使其获得最佳的纯化效果。 结果 1成功构建rhLEDGF p52 基因原核表达载体,酶切鉴定插入正确,插入序列经Invitrogen公司测序部分析,该序列与GenBank 中编码人的LEDGF p52 序列完全相同。 2在大肠杆菌 BL21(DE3)中获得表达(可溶性形式表达,表观分子量35kD 左右),以2mmol/ L 终浓度的IPTG诱导效果最好,在诱导后6h蛋白表达量最高,rhLEDGF p52蛋白表达量占菌体蛋白总量的34.63%。 3 Western Blotting 结果显示诱导后的上清中有能与抗LEDGF-单抗反应的蛋白,表观分子量35kD 左右,与目的蛋白的理论计算值相吻合,而诱导前的全菌中却没有条带出现,即rhLEDGF2蛋白能够特异性与 LEDGF-ab 结合。 4Ni-NTA His.Bind.Resin方法进行纯化,以50 mmol/ L终浓度的咪唑洗脱液洗脱目的蛋白的效果最佳,纯化后的rhLEDGF p52,终浓度达 520μg/ml,分析其纯度达87.93%。 结论 成功获得rhLEDGF p52蛋白,这为深入研究其生物学功能奠定了基础。
会议投稿录入:aya610    责任编辑:毛进 
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