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NT4-NAP融合基因的构建与重组腺伴随病毒的制备
作者:佘华宁  …  文章来源:西安交通大学第二医院眼科 710004  点击数908  更新时间:2006/6/29 20:00:30  文章录入:sunnx  责任编辑:毛进
目的 构建神经营养素-4(neurotrophin-4 NT4)与神经短肽(NAPVSIPQ NAP)融合基因重组腺伴随病毒,为进一步对视网膜色素上皮疾病进行基因治疗奠定基础。 方法 NT4-NAP融合基因构建及序列分析采用非对称互补引物/模板法。以pGFP-N2质粒作模板,使用PCR方法获得GFP片断。将该片断插入到pSSHG-CMV穿梭质粒,构建为重组pSSHG-CMV-GFP穿梭质粒。制备表达NAP和GFP的两种重组腺伴病毒rAAV-GFP和rAAV-NAP;纯化病毒,以斑点杂交法测定病毒滴度。融合基因重组于pGEM-Teasy质粒中,筛选得到含有NT4-NAP基因的克隆,采用Sanger单链末端终止法测出全部的核苷酸序列。 结果 经DNA测序,限制性内切酶酶切等方法证实已成功地将NAP重组到NT4信号肽和前导序列的3c端。标准AAV质粒的浓度为1g/ml,根据杂交结果,可计算出每ml中的重组病毒颗粒数(重组病毒的滴度)。 结论 成功制备了表达NAP和GFP的两种重组腺伴病毒rAAV-GFP和rAAV-NAP,为视网膜色素上皮疾病基因治疗奠定了基础。
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