| 目的 观察p42/p44 MAPK信号通路在缺氧条件下对人RPE细胞表达HIF-1α和VEGF的影响。方法 在细胞培养液中加入200µM CoCl2建立人RPE细胞缺氧模型，用20μM p42/p44 MAPK上游特异性阻断剂PD98059处理RPE细胞，在相应条件下分别培养0、5、10、30、60和120min，Western blot检测磷酸化p42/p44 MAPK表达；将缺氧RPE细胞培养1、4、8、24h，用Western blot、RT-PCR检测p42/p44 MAPK信号通路阻断前后RPE细胞内HIF-1α mRNA 及蛋白的表达；在1、3、6、12和24h时间点用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbant assay, ELISA）检测缺氧RPE细胞在p42/p44 MAPK信号通路阻断前后上清液中VEGF的含量以及用免疫荧光染色法检测细胞中VEGF的表达；利用缺氧24h时RPE细胞条件培养基培养人脐静脉内皮细胞，分别培养1、2、3、4d后用四甲基偶氮唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazole-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT ]比色法检测人脐静脉内皮细胞的增生。对照组均为未经PD98059处理细胞。
结果 Western blot显示缺氧1、4、8和24h时，均有磷酸化p42/p44 MAPK表达，24h水平降低。相应PD98059处理组磷酸化p42/p44 MAPK水平降低。RT-PCR显示在缺氧1、4、8和24h时，RPE细胞中HIF-1αmRNA含量随时间逐渐增加，8h开始降低；半定量显示PD98059处理组和对照组HIF-1α mRNA表达量无差异。Western blot显示在缺氧能够诱导HIF-1α的表达，随时间HIF-1α蛋白表达逐渐升高，条带介于103 和120kD之间，PD98059处理后的HIF-1α表达条带在分子量103kD处较致密；ELISA证实，缺氧作用1、3、6、12和24h时，RPE细胞上清液中VEGF含量随时间逐渐增加（P<0.01），PD98059处理组VEGF含量较对照组显著减少（P<0.01）。免疫荧光染色法也证实细胞内VEGF的表达在PD98059处理组同样也表达下调。MTT显示，PD98059处理后的RPE条件培养基处理人脐静脉内皮细胞增殖较慢，缺氧1、2、3和4 d时,对照组与缺氧组各时间点A值均相差显著(P <0.01)。
结论 缺氧条件可激活p42/p44 MAPK信号通路，并且缺氧能够上调RPE细胞内HIF-1α mRNA的表达，其能够诱导明显的HIF-1α蛋白表达，p42/p44 MAPK对HIF-1α表达没有影响，但可以使HIF-1α活化，从而激活转录下游基因的表达；缺氧可促进RPE细胞表达VEGF升高，p42/p44 MAPK信号转导通路可能参与了缺氧刺激引起的人RPE细胞VEGF的表达；缺氧刺激使RPE细胞分泌的VEGF能够刺激人脐静脉内皮细胞的增殖，p42/p44 MAPK信号通路阻断后VEGF表达量减少，人脐静脉内皮细胞增殖减弱。
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