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糖尿病大鼠视网膜白细胞黏附与视网膜神经胶质细胞活化的研究
作者:唐仕波  …  文章来源:中山大学 中山眼科中心  点击数1314  更新时间:2006/7/2 23:01:03  文章录入:mahongjie  责任编辑:毛进
目的 观察在糖尿病视网膜病变过程中视网膜血管紧密连接蛋白Occludin的时空表达改变、神经胶质细胞的活性改变以及白细胞黏附的发展过程,探讨在糖尿病病变过程中视网膜胶质细胞活化、血-视网膜屏障及白细胞黏附之间的时程关系。 方法 1. 血-视网膜屏障功能的形态学观察: 成年雄性Wistar大鼠,STZ腹腔注射诱导糖尿病,分别取成模后2周、1、3、6个月大鼠行伊凡思蓝(EB)静脉注射,2小时后摘出眼球,固定后取视网膜制备全视网膜平铺片,用激发光为546nm波长的滤光片在荧光显微镜下观察染料的位置并摄片。 2. 视网膜铺片Occludin表达时空动态变化 成模后2周、1、3、6个月大鼠行心脏灌注去除血管中血液成分,摘除眼球,固定后取视网膜制备全视网膜铺片,应用免疫荧光组织化学技术检测Occludin的表达及形态改变,用激光共焦扫描显微镜(激发波长为488nm激光)观察并摄片,并应用Z-stacks功能重建同一血管节段紧密连接的立体结构。 3. 神经胶质细胞活性标记蛋白——GFAP的时空表达变化 分别取成模后2周、1、3、6个月大鼠眼球固定、石蜡包埋、切片后,应用免疫荧光组织化学技术检测GFAP的动态表达变化,荧光显微镜观察。取成模后1、3、6个月大鼠行心脏灌注去除血管中血液成分,摘除眼球,固定后取视网膜制备全视网膜铺片,应用双标免疫荧光组织化学技术检测ZO-1/GFAP的表达及形态改变,利用ZO-1标记视网膜血管,显示胶质细胞与血管之间的关系。用激光共焦扫描显微镜(激发波长为488nm激光)观察并摄片。 4. 粘附分子(ICAM-1,VCAM-1)及白细胞-血管内皮细胞粘附的动态变化 分别取成膜后2周、1、3、6个月糖尿病大鼠左眼做石蜡切片,经心脏灌注后取右眼做视网膜消化铺片,并在切片和/或铺片上进行ICAM-1、VCAM-1及CD45单克隆抗体免疫组化研究,并进行相应的定性及半定量分析。 上述所用研究均以同样数量的同龄正常Wister大鼠作为正常对照。 结果 1. 血-视网膜屏障功能改变 EB注射后,视网膜平铺片在荧光显微镜下可清晰地观察到视网膜各级血管的形态。正常状态下视网膜血管管壁清晰,染料在血管内没有外漏。糖尿病1个月的大鼠视网膜血管内的荧光染料未见明显渗漏增加,仅见背景荧光增强;糖尿病3个月后出现局部的渗漏,以毛细血管的渗漏增强为主;糖尿病6个月出现广泛的荧光燃料渗漏,血管壁模糊。 2. 视网膜铺片Occludin表达动态变化 正常大鼠Occludin表达于视网膜各级血管中,形态各异。在毛细血管呈双线或单线状,以双线为主;动脉中呈网状规则排列。糖尿病起病后1个月大鼠血管Occludin虽未见荧光强度减弱但可见形态的改变,排列紊乱,局部出现点状荧光增多。Occludin的表达在3个月时明显下降,动脉及毛细血管中可见荧光网线的中断,毛细血管以单线为主。6个月时,可见视网膜毛细血管中以单线状表达为主伴中断,动脉中可见网格稀疏,排列异常弯曲。 3. 视网膜神经胶质细胞活性状态的动态变化 正常大鼠视网膜仅神经纤维层及神经节细胞层见GFAP阳性红色荧光染色;成模1月后糖尿病鼠神经纤维层及神经节细胞层内GFAP表达增多;成模3月后不仅在神经纤维层及节细胞层中荧光强度增加,还可见丝状荧光贯穿内外核层;6个月后此改变更为明显。 ZO-1/GFAP双标的视网膜铺片可见ZO-1呈绿色荧光与Occludin分布形态相似,分布于各级视网膜血管,清晰显示视网膜各层中各级血管的分布及走行。正常大鼠内层视网膜可见红色荧光染色的星形胶质细胞伸出血管足整齐地附着于视网膜内层血管,外丛状层毛细血管网中未见红色荧光。在成模1月后每视野中GFAP阳性的星形胶质细胞数量明显增多,胞体缩小,突起缩短,附着于血管的细胞突起数量增多,且排列较正常紊乱,外丛状层毛细血管网处无可见红色荧光。成模3月后,星形胶质细胞数量较1个月时有所减少,胞体肥大,突起缩短减少,细胞间出现点状红色荧光染色,围绕血管的突起明显增多排列紊乱,在视网膜外丛状层毛可见点状红色荧光染色;6个月后GFAP阳性星形胶质细胞胞体皱缩,突起短小,每高倍视野中胞体数量减少,可见大量粗短线状荧光纠集附着于血管壁,外丛状层点状荧光较3个月时更为密集。 4. 白细胞-血管内皮细胞粘附的动态变化 正常对照组:ICAM-1在视网膜神经纤维层、神经节细胞层、外丛层及内核层的毛细血管中呈弱阳性表达,CD45在视网膜神经纤维层、神经节细胞层的毛细血管中呈弱阳性表达。视网膜毛细血管中见少许CD45阳性细胞,但未见VCAM-1表达。糖尿病2周组见视网膜神经纤维层、神经节细胞层、外丛状层及内核层中ICAM-1和CD45的表达增强,视网膜毛细血管中CD45阳性细胞增多,并见少许VCAM-1阳性细胞,可见视网膜毛细血管中白细胞呈串珠样粘附、堆积。1、3、6个月组与2周组比较无明显差异(P>0.05)。 结论 糖尿病性视网膜中粘附分子(VCAM-1、ICAM-1)的过渡表达和白细胞在视网膜毛细血管中的粘附、堆积均发生在DM病程的早期,是DR在微血管水平变化的开端。而血-视网膜屏障功能的改变及神经胶质细胞的活化,均发生于白细胞黏附达高峰之后。此后,Occludin、GFAP、CD45的表达和/或分布具有时间的一致性。因此,在糖尿病视网膜病变过程中视网膜胶质细胞活化、血-视网膜屏障及白细胞黏附三者之间存在紧密的联系。且进一步说明粘附分子介导的白细胞与血管内皮细胞粘附增多导致血管内皮细胞的损伤是DR发展过程中的关键,并与神经胶质细胞的活化及其突起的趋化有着紧密的联系。
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