| 摘要：目的 移植雪旺细胞是目前最有希望促进视神经再生的方法之一，为增强其功效，拟构建CNTF-GFP融合表达的质粒载体，以电穿孔法转染雪旺细胞，为视神经再生研究提供一种效果更佳且便于观察的手段。方法 从pNUT-hCNTF-DT质粒中设计引物分别扩增出hCNTF的两条外显子，然后拼接成hCNTF cDNA, 将其插入pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO的TOPO酶位点中，构建重组质粒pcDNA3.1/GFP-CNTF; 经测序鉴定后用电穿孔法转染雪旺细胞；荧光显微镜下动态观察转染效果；转染24h后，抽提其RNA行RT-PCR观察基因转录情况，细胞免疫组化法观察蛋白表达情况。结果 重组质粒经测序鉴定无误；在3h即可见部分荧光，12h逐渐增多，24h到达高峰；转染24h后，RT-PCR表明目的基因有较高转录，免疫组化示有CNTF蛋白的高表达，并与GFP蛋白表达部位完全重合。结论 成功构建了CNTF-GFP融合表达质粒，并用电穿孔法转染雪旺细胞后，证实有较高表达，为制备转基因的种子细胞从而促进视神经再生的研究奠定了基础。 |
