| 目的：建立恒河猴骨髓间充质干细胞的体外分离、克隆筛选培养及扩增的新方法。并探索在体外基质微环境中诱导骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cell ,MSC）向角膜上皮样细胞方向分化的条件，为临床利用骨髓间充质干细胞修复眼表提供前期实验资料。方法：采用密度梯度离心结合贴壁法分离 MSC，利用克隆筛选培养法获得高质量、高纯度的MSC。取生长良好的细胞进行形态学观察、染色体检测、生长曲线测定、细胞周期检测，并应用流式细胞分析结合免疫组化方法及多向分化潜能实验鉴定克隆化培养的细胞。取P3代克隆化MSC，接种在预置有去上皮羊膜基质的Transwell 6 孔培养板底，在Transwell体系中与原代恒河猴角膜缘上皮细胞非接触性共培养，分三组进行诱导实验：A组基础培养液由90% L-DMEM和10％胎牛血清构成；B组培养液由基础培养液添加10μg/ml insulin、8μg/ml Retinoic acid 、10ng/ml EGF、10ng/ml bFGF构成；C组培养液由B组培养液添加1μg/ml LPS构成。诱导10天后分别用光镜、电镜观察诱导后细胞形态、免疫组织化学和流式细胞分析检测诱导细胞的标志物表达情况。结果：经克隆筛选培养的传代MSC，细胞呈均匀分布的集落样生长；染色体检查核型正常；细胞周期及细胞生长曲线测定显示细胞增殖能力强；标志蛋白检测显示Vimentin、a-SMA、CD44和 CD29阳性，CD34、CD45、CD80、CD86、CD106及HLA-DR阴性；多向分化潜能实验显示细胞具备向成骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经样细胞分化的能力；提示培养的细胞是骨髓来源的有多向分化能力的间充质干细胞。P3代克隆化MSC在体外基质微环境中诱导10天后，C组MSC光镜、电镜显示出上皮样细胞结构，免疫组化及流式细胞检测结构显示诱导后的细胞表达角膜上皮前体细胞的标志蛋白Integrinβ1、Cx43、Pax6和P63。结论：利用密度梯度离心结合贴壁法分离MSC，联合克隆筛选法培养,可以得到一定数量、高纯度、高质量的MSC，细胞在体外连续培养至15代仍保持旺盛的增殖能力和稳定的遗传性能。MSC体外基质微环境中经刺激因子干预联合细胞因子有诱导MSC向角膜上皮前体细胞诱导分化的趋势，为探索将MSC用于眼组织工程中种子细胞的来源提供了思路。本课题受“十一五”科技攻关项目(No.2004BA720A15)，国家自然基金(No.30271386, No.30672275)，广东省自然基金(No.2005B30901002, No.06300679)和中国博士后基金(No.2005037616)资助。 |
