目的:研究体外培养的视网膜Müller细胞胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein ,GFAP)和谷氨酰胺合成酶(glutamamine synthetase, GS)在细胞外高浓度谷氨酸的环境下对谷氨酸的转运作用。
方法:1 恒温摇床法纯化体外原代培养的大鼠视网膜细胞,免疫细胞化学法鉴定细胞(GFAP、GS);HE染色观察细胞形态。 2 在传代早期Müller细胞的培养基内加入高浓度的谷氨酸(1.5mM)分别作用一天、四天,MTT比色法测定细胞的活力,并进行细胞HE染色,观察细胞形态;采用免疫细胞化学染色法观察在高浓度的谷氨酸作用一天后GFAP和GS的表达情况。
结果:恒温摇床法纯化后细胞GFAP、GS均为阳性,且呈现均匀一致的细长形态,突起少,折光性暗,细胞核椭圆形,这与Müller细胞特点相符。高浓度谷氨酸作用细胞一天后,细胞的分裂生长加强,细胞活力增加,细胞形态没有明显变化;GFAP表达明显增加(平均光密度值明显增加),但GS表达没有显著变化。
结论:恒温摇床法是纯化Müller细胞简单有效的方法;在正常状态下,Müller细胞表达GFAP和GS蛋白。GFAP参与谷氨酸的转运,受到刺激后早期表达明显增加。GS是细胞转化谷氨酸的关键酶,受到刺激后早期变化不明显。高浓度谷氨酸的细胞外环境下,Müller细胞对谷氨酸的转运增多,而代谢相对滞后引起谷氨酸代谢紊乱是引起兴奋性毒性作用,造成细胞受损的原因之一。
|