| 目的：
通过清除角结膜的巨噬细胞、建立小鼠真菌性角膜炎模型，研究真菌性角膜炎发生发展中巨噬细胞的作用及其与Toll样受体-4（TLR4）表达的关系。
方法：
实验分为PBS–LIP组（空白对照组）和Cl2MDP –LIP组（巨噬细胞缺乏组），Cl2MDP –LIP组小鼠在感染真菌前7天和2天环绕角膜缘球结膜下注射Cl2MDP –LIP悬液以清除巨噬细胞，应用角膜表层镜法建立两组茄病镰刀菌和白色念珠菌性角膜炎模型。在角膜接种菌液后第1、3、5、7天，裂隙灯显微镜观察角膜炎症变化和病理损害特点，并根据角膜混浊的面积、密度和表面的规则性对真菌性角膜炎的严重性进行临床评分；HE染色观察角膜病理变化和炎症细胞浸润情况；感染的角膜组织进行匀浆、真菌培养和菌落计数；冰冻切片免疫组化荧光染色检测角膜中F4/80（巨噬细胞）、CD4+淋巴细胞的表达；RT-PCR与ELISA检测角膜中Thl型细胞因子（IFN-γ、IL-12）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）基因mRNA及蛋白的表达。免疫组化与RT-PCR检测角膜中TLR4及其基因mRNA的表达，免疫组化荧光双染色检测TLR4与F4/80（巨噬细胞）表达的关系。
结果：
茄病镰刀菌和白色念珠菌性角膜炎的实验结果基本相似。角膜接种菌液后，Cl2MDP –LIP组周边角膜炎症反应较轻，中央区局部明显水肿、溃疡、坏死，角膜易穿孔（大多发生在第7天）； PBS–LIP组角膜炎症反应重，角膜弥漫性混浊，新生血管大量生长，但较少穿孔（发生在第5天）。临床评分结果显示，Cl2MDP –LIP组角膜炎呈进行性发展，第1天为轻度，第3天发展为中度，第5、7天恶化为重度；而PBS–LIP组角膜炎一开始就表现为中度，第3天发展达高峰（重度），以后逐渐减轻为中度。HE染色可见Cl2MDP–LIP组第1、3天角膜及前房中炎症细胞浸润的数量少，仅中央区局部角膜水肿、浸润，第5天溃疡处组织坏死，多量的中性粒细胞浸润；PBS–LIP组第1天起可见角膜缘、角膜基质及前房中有大量的多形核白细胞浸润，第5天后炎症细胞减少，角膜基质中纤维细胞增多，周边可见新生血管。真菌培养菌落计数结果显示，Cl2MDP–LIP组在角膜接种菌液后第1、3天可见较多菌落生长，第5、7天菌落减少；PBS–LIP组在第1天可见较多真菌菌落，以后逐渐减少，明显少于Cl2MDP–LIP组（P<0.05），第5、7天几乎未见真菌生长。免疫荧光染色结果表明，正常角膜中未见F4/80（巨噬细胞）与CD4+淋巴细胞阳性表达；角膜接种菌液后，Cl2MDP –LIP组角膜中未见或有极少量的F4/80阳性表达，少量的CD4+淋巴细胞表达；而PBS–LIP组中都可见大量的F4/80、CD4+淋巴细胞表达。RT-PCR检测结果发现，Thl型细胞因子（IFN-γ、IL-12）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）基因mRNA在正常角膜中几乎未见表达；而角膜接种菌液后，在Cl2MDP –LIP组和PBS–LIP组中均出现表达，且Thl型细胞因子（IFN-γ、IL-12）的表达大多显著强于Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）（P<0.05）；各个因子对应时间点在Cl2MDP –LIP组中的表达大多显著弱于PBS–LIP组（P<0.05），以IL-12尤其明显；在Cl2MDP –LIP组中各个因子呈持续表达并出现表达的紊乱，而在PBS–LIP组中，各因子的表达呈持续下降趋势；ELISA对角膜中IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10蛋白的检测结果与mRNA的变化趋势基本一致。角膜中TLR4及其基因mRNA的检测结果发现，正常角膜中几乎未见TLR4阳性表达；角膜接种菌液后角膜的上皮、基质中可见到TLR4表达，但Cl2MDP –LIP组的表达显著弱于PBS–LIP组（P<0.05）。抗TLR4与F4/80免疫荧光双染色结果表明，F4/80与TLR4的表达呈平行关系，F4/80阳性表达的细胞大多伴有TLR4的表达，TLR4除了表达于F4/80阳性细胞外，还可见于其他组织细胞。
结论：
巨噬细胞缺乏时，角膜的免疫功能减弱，真菌清除延缓，炎症反应减轻，角膜易坏死、穿孔；巨噬细胞能通过促进炎性细胞因子的分泌、多种免疫细胞的募集、增殖等而在真菌性角膜炎的抗感染免疫过程中发挥重要作用；巨噬细胞能促进TLR4的表达，可能通过表达TLR4识别真菌，从而介导真菌性角膜炎的免疫炎症反应。
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