| 目的 探讨p16INK4a、p21WAF1/CIP1、p27KIP1和p53等在细胞衰老过程中起重要作用的基因在体外不同年龄的正常人角膜内皮细胞中表达情况。方法
收集临床上DX液保存的行角膜移植手术后剩余的周边角膜环状组织，记录供体年龄。切取部分组织经台盼蓝-茜素红双染法，观察角膜内皮细胞的活性；并行石蜡切片HE组织学染色，保证角膜材料组织结构的正常。对18、33、54、68岁的正常角膜环行冰冻切片后进行免疫组化检测，以及对不同年龄段（20、30、40、50、60岁，共5组，每组含相近年龄的3～4个角膜环）的角膜，每组获取单一的角膜内皮细胞，行RT-PCR检测。将20、24、26、30、50、55、56、60岁八组正常HCECs（每组含相近年龄的3～4个角膜环），分别提取总RNA，行实时荧光定量PCR检测，观察p16INK4a、p21WAF1/CIP1、p27KIP1和p53基因随年龄的表达情况。将结果分为两组，≤30岁为年轻组，≥50岁为老年组，利用非配对t检验对两组差别进行统计学分析。采用中性衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence associated β-galactosidase, SA-β-GAL）细胞化学染色方法，对不同年龄（9、17、23、57、65、67岁）角膜内皮细胞染色的情况进行观察。结果 术后即刻台盼蓝-茜素红双染显示角膜内皮细胞的平均细胞密度为（2391.4±84.6）个/mm2，活性率为（84.4±5.3）％。HE染色结果示角膜上皮、基质和内皮各层结构完整，排列规则。冰冻切片的免疫组化结果可见p16INK4a、p21WAF1/CIP1、p27KIP1和p53等各衰老相关基因在角膜内皮细胞中均有表达，且阳性表达位于细胞核内。对各年龄段正常HCECs行RT-PCR检测，结果显示p16INK4a、p21WAF1/CIP1、p27KIP1和p53各衰老相关基因的目的条带存在，表达阳性。荧光实时定量PCR检测显示各年龄段四种基因表达量强弱不等，p16INK4a的表达在老年组大于年轻组（t=3.402,P=0.014），p21WAF1/CIP1、p27KIP1和p53两组表达没有统计学差异。SA-β-GAL染色显示年轻者没有或者偶见呈现蓝染的阳性细胞，且染色较浅，老年者则阳性细胞多见，且染色较深。结论 体内HCECs随年龄增长会发生衰老改变，各年龄段HCECs中均有衰老相关基因的表达， p16INK4a的相对表达量随年龄增加而增高，其介导的衰老通路可能在正常HCECs衰老的过程中发挥着重要作用。
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