| 目的 探讨角膜层间显微注射外源性标志基因-绿色荧光蛋白（GFP）转染角膜组织的有效性和安全性。方法 纯化携带标志基因GFP的重组质粒PEGFP-C2，浓度为0.5ug/ml。显微镜下使用微量进样器对Wistar大鼠角膜层间注射质粒溶液4ug。注射后不同时间点（12h、24h、72h、14d、21d、28d）处死实验鼠，使用荧光显微镜对GFP表达水平及范围进行动态示踪，HE染色和透射及扫描电镜对GFP转染角膜组织组织结构进行比较分析。AE5、P63抗体标记角膜上皮细胞层细胞构成的变化。结果 显微注射后质粒溶液在角膜层间均匀弥散，角膜轻度水肿，24h后恢复透明。荧光显微镜下见角膜组织呈现绿色条带，提示标志基因GFP表达，24h在注射部位前基质层表达明显，72h后全角膜均见表达，以上皮层和基质层为主。GFP表达水平随观察时间延长而减弱，但4w时仍有阳性表达。HE染色显示注射初期角膜层间纤维间隙增大，72h后恢复正常，组织结构无损害。电镜证实角膜上皮细胞和基质细胞内可见质粒颗粒，未见细胞毒性变化。转染后角膜上皮细胞层表达AE5阳性，角膜缘基底细胞层表达P63阳性，表明角膜上皮层的构成和表型未发生变化。 结论 层间显微注射可将外源性基因安全、相对高效的转染角膜组织，提供了新的基因角膜转染方法。 |
