| 目的：巩膜的主要成分是胶原，羟脯氨酸(hydroxyproline,简写为Hyp)是构成胶原的主要成分之一，在胶原中含量相对稳定，约占胶原氨基酸总量的13%，胶原以外的其他蛋白，除弹性蛋白含少量Hyp外(约为1%)，均不含Hyp，因此组织的Hyp含量测定已成为衡量组织胶原含量的特异性指标。本实验旨在选出巩膜组织的最佳水解酶，确定该酶的最适水解时间，简化、优化巩膜Hyp测定生化方法，为进行巩膜胶原研究提供实验证据。
方法：采用酶解反应结合盐酸水解法测定组织Hyp含量。
(1)在各自最适温度、pH值条件下，胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K水解速率的比较：取6只人眼巩膜，每一巩膜样本均分三份，分别装在3个试管内。三管各加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K溶液 3ml，置37℃温箱内水解24小时、48小时，取上清液0.5ml测定蛋白含量。
(2) 胃蛋白酶对巩膜组织最适水解时间的确定：取6只兔眼巩膜，每一巩膜样本均分三份，分别装在3个试管内，每管各加入胃蛋白酶3ml，置37℃温箱内水解4小时、12小时、24小时，到时后取上清液0.5ml测定蛋白含量，剩余的2.5ml继续Hyp测定过程（详见参考文献），算出Hyp含量。
结果：
1 三种蛋白酶水解速率的比较：巩膜组织经24h水解后，胃蛋白酶组的蛋白质含量明显高于蛋白酶K、胰蛋白酶组(P＜0.05)，蛋白酶K、胰蛋白酶组的水解速率无统计学差异(P＞0.05)。经48h水解后，胃蛋白酶组的蛋白质含量明显高于蛋白酶K组，蛋白酶K组大于胰蛋白酶组，其中任两组间比较均有统计学差异(P＜0.05)。同一种蛋白酶，24h、48h所测蛋白质含量均无差异(P＞0.05)。
2 胃蛋白酶水解巩膜不同时间后蛋白质含量的比较：24h测得的蛋白质含量显著高于4h、12h(P＜0.05)，4h、12h所测蛋白质含量无差别(P＞0.05)。
结论：
1 在测定巩膜Hyp含量时，胃蛋白酶的水解效果明显优于蛋白酶K、胰蛋白酶。胃蛋白酶对巩膜组织的最佳水解时间为24小时。
2 送检充分消化的巩膜组织测定蛋白质总含量，使Hyp测量单位由μg/mg组织变为μg/mg蛋白，降低了非蛋白成分(如水、脂肪等)造成对实验结果的影响，提高了Hyp含量精确程度，使结果更加客观。
3省去组织研磨步骤，把干燥后的巩膜剪碎后直接放入试管内进行消化，减少了研磨造成的组织损失，使被测样本重量可减少至10mg，适于微量组织Hyp检测。
4以胃蛋白酶消化后的组织用盐酸进行水解时，把样品放入高压锅内水解30分钟，缩短了水解时间，因加热促使分子键断裂，故水解更充分。
5将过滤去杂质的步骤改为低速离心取上清液(1000转/分)，减少组织丢失，增强结果的可比性。
|
