grp78真核表达载体的构建及在视网膜色素上皮细胞中的表达
李漫丽 吴雅臻 金燕
长春市吉林大学第二医院眼底病科，130041
目的：构建人grp78真核表达载体，并在视网膜色素上皮细胞（RPE）中表达，为进一步研究grp78的功能提供基础。
方法：1.以克隆载体POTB7－grp78为模板， PCR扩增人grp78全长序列，产物与载体PEGFP-N1分别双酶切后行定向连接，转化感受态细胞，以PCR方法鉴定阳性克隆，并进行测序和分析比对，获得融合蛋白表达质粒载体pEGFP-grp78 。2.体外培养人RPE细胞（D407），脂质体介导将重组质粒grp78-pEGFP转染入RPE细胞，RT-PCR观察转染后24h、48h、72h grp78 mRNA的表达情况，荧光显微镜观察转染后48小时GFP的表达。
结果：1. PCR获得长度为1981 bp的目的片段；经pEGFP-grp78载体连接、筛选及测序分析后，证实所插入的目的片段与genebank的人grp78序列完全匹配；2. 融合蛋白在RPE细胞中成功表达，RT-PCR分析显示，在转染后24h即出现grp78的表达增加，72h时仍有持续表达。
结论：pEGFP-grp78真核表达载体成功构建，并在人RPE细胞中稳定表达，为研究grp78抗细胞凋亡作用及其机制提供了工具。
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