辅助性腺病毒的构建及鉴定 闫丽 赵堪兴 天津市眼科医院 通讯地址：天津市和平区甘肃路4号 目的 人类基因疗法中基因导入的安全性是目前面临的最大挑战。第一代、二代腺病毒载体，由于病毒残余基因的表达可引起宿主强烈的免疫反应。第三代复制依赖性腺病毒（HD-Ad）载体系统完全去除了Ad的结构蛋白，降低了免疫反应，使治疗基因在体内稳定表达的时间延长。本文为研究HD－Ad体系应用于视网膜新生血管基因治疗的可行性，构建HD－Ad体系中的辅助性腺病毒以及表达Cre重组酶的真核表达载体，并对Cre切除辅助病毒包装信号的有效性进行分析。方法 以PCR及酶切连接的方法将同向的两个loxP位点和绿色荧光蛋白表达盒依次克隆入pShuttle穿梭载体质粒，按照AdEasyTM系统的标准实验方法进行辅助病毒的生产和扩增。同时构建pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体，脂质体转染HEK293细胞，通过PCR和流式细胞术分析细胞内表达的Cre重组酶对其后感染的辅助病毒包装信号的切除作用。结果 构建的辅助性腺病毒能够在HEK293细胞内包装和扩增，其包装信号可以被细胞内表达的Cre酶有效切除。结论 成功构建了辅助性腺病毒和pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体。为第三代腺病毒的生产和视网膜新生血管基因治疗的研究奠定了实验基础，从而为视网膜血管性疾病的基因治疗提供更安全有效的载体系统。
|
