| 目的：人角膜上皮细胞（HCECs）是研究角膜结构与功能的重要材料，而原代培养的方法非常复杂且效率不高，试验旨在构建一株新的细胞系。
方法：
HCECs分离和原代培养
取尸体眼的角膜片，PBS冲洗后DispaseⅡ消化后刮取上皮，离心收取细胞，加含15％FBS的1：1的DMEM/F12培养液，混匀后接种于24孔板，放CO2培养箱中培养。
慢病毒包装与转染
主体质粒（Lenti-tag,含SV40largeT基因）与辅助质粒混合后加入CaCl2转导的293T细胞培养基中，14h后更换培养液，培养28h，收集上清夜。离心过滤再离心，沉淀拥PBS悬浮，保存于－80℃冰箱。
细胞系建立
原代HCECs接种于24孔板，加入病毒颗粒和Polybrene，7天后挑取单克隆培养传代。
RT-PCR检测Tag 的表达
取病毒感染的HCECs和正常HCECs，抽取mRNA，半定量PCR检测Tag的表达，含EB的琼脂糖电泳检测结果。
免疫荧光法检测HCECs中表面标志CK-3/CK-12的表达
细胞固定封闭后，加入鼠抗人CK-3/CK-12单克隆一抗，孵育后，再加入耦联Rhodamin的羊抗鼠IgG二抗孵育，免疫荧光显微镜检测。
结果：Lenti-Tag感染的角膜上皮细胞40周内持续生长，增殖超过100代，并具建系细胞的形态特征。免疫荧光显示CK-3/CK-12再建系细胞均有阳性表达。角膜上皮的各传代细胞与原代细胞相比，染色体核型表现基本一致。
结论：慢病毒介导永生化基因感染的方法能使基因整合至染色体，表达更稳定，节约成本。实验构建的永生化HCECs，传100代后仍能表达HCECs的特异性marker和形态特征，说明其完全可以作为该细胞体外研究的模版。 |
