| 目的 构建绿色荧光蛋白GFP- p21融合基因表达载体，并观察其在人视网膜色素上皮细胞中的表达及定位，为研究细胞周期蛋白激酶抑制因子p21对视网膜色素上皮细胞细胞周期的影响提供实验基础。方法 以含有p21的全长序列的质粒为模板PCR扩增p21 cDNA，应用基因重组技术与GFP基因融合，构建以绿色荧光蛋白GFP为报告基因的重组表达质粒pGFP- p21。利用脂质体转染体外培养的人视网膜色素上皮细胞，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pGFP- p21融合蛋白在细胞中的分布和定位，分别用RT－PCR和western blot方法分析其mRNA和蛋白的表达。结果 ①酶切、DNA测序均证实插入片断的正确性。②荧光显微镜观察结果显示在空载体pEGFP－C1转染组中，细胞内绿色荧光呈弥散分布；重组质粒pGFP－p21转染组中，绿色荧光主要集中在细胞核内。③RT－PCR，Western Blot 证实了pGFP－p21 融合基因的表达。结论 成功的构建了pGFP－p21质粒。视网膜色素上皮细胞能高效表达pGFP－p21融合基因，且主要定位于细胞核内，与p21基因的表达方式相同。GFP作为报告基因，其荧光强度与分布可反应融合基因表达情况及亚细胞定位，为进一步研究目的基因功能提供了线索。 |
