人胚胎视网膜干细胞体外培养
曾玉晓 陈丽峰 翁传煌
第三军医大学西南眼科医院 重庆 400038
目的：尝试对人胚胎视网膜干细胞的体外培养，并对其冷冻保存后进行复苏后再培养、诱导分化及鉴定，以观察低温冻存对视网膜干细胞生物学特性的影响。
方法：将12-20周的人胚视网膜神经感觉层消化20分钟，吹打成细胞悬液。以2×105－4×105个/cm2的密度种植，培养液为无血清培养基。培养3-5d后，原代悬浮细胞团传代，以后每隔5～7d传代1次。3代之后行10%胎牛血清的DMEM/F12+bFGF+EGF诱导分化、鉴定、冻存和复苏观察。
结果：1）视网膜细胞24小时后部分细胞分裂形成小细胞团，并随培养时间的推移细胞数目迅速增加，成为数十个细胞到数百个细胞的悬浮克隆球，随着培养时间增长，克隆球增多增大。发现第5代的细胞克隆球出现生长缓慢，增殖现象不明显。2）分别选取冻存不同时间的视网膜干细胞，用含有10 %BSA 的复苏液对之进行复苏，发现冻存时间对复苏后细胞存活率的影响没有显著性差异，形态上也未见差别。免疫细胞荧光化学染色可见培养的神经球Nestin及CHX-10阳性。
结论：成功建立培养人胚胎视网膜干细胞的方法，并能进行有效冻存复苏免疫细胞荧光化学染色，表明细胞具有神经干细胞特性，同时也具有视网膜干细胞特性，且细胞能分化星形胶质细胞、muller细胞以及成熟神经元等。 |
