目的 研究PCR结合DNA测序对真菌性角膜炎的诊断意义。
近年来由于抗菌素及皮质类固醇的广泛应用及糖尿病和获得性免疫缺陷综合证患者群体人数的增加，真菌性角膜溃疡发病率明显增高，发展成一种严重影响视力的感染性疾病，如不及时得到有效地治疗，往往导致严重后果。虽然临床病史及眼部体征有助于真菌性角膜炎的诊断，但是，真菌性角膜炎的临床表现复杂，因此可靠准确的诊断必须依靠实验室技术。现在临床上常用的真菌性角膜炎诊断方法是建立在组织形态学和生理学基础上的KOH湿片法、角膜刮片培养法和共焦显微镜法。KOH湿片法（The potassium hydroxide （KOH）wet mount）简便、快速，但操作中偶然性大，阳性率低，且不能鉴定菌种。角膜刮片培养法结果可靠，同时可鉴定菌种，但费时太长，对临床治疗指导意义不大。共焦显微镜（CONFOCAL MICROSCOPE）诊断真菌性角膜炎具有快速、无创、灵敏度高的特点，但共焦显微镜需要病人密切配合，任何微小的眼球运动都会使图像模糊，不适合对儿童、体弱者和角膜穿孔病人进行检查并且共焦显微镜进行的是形态学检查，不能鉴定菌种，而且价格昂贵，不宜推广。
在就诊的第一时间明确诊断并给予合理的治疗是决定真菌性角膜炎预后的重要因素，自1995年Alexandrakis 等首次成功将PCR技术用于诊断镰刀菌性全眼球炎以来，PCR作为一项快速、灵敏、特异诊断真菌性角膜炎的新技术逐渐受到人们的重视。应用真菌性特异性引物配合PCR扩增技术诊断真菌性角膜炎比传统的实验室技术更加灵敏、快速、特异。扩增目的序列的选择是决定PCR特异性的关键，真菌核糖体RNA（rRNA）基因是公认的多拷贝高保守基因，存在于所有的真菌中，而存在于真菌18SrDNA和5.8SrDNA基因组之间、5.8SrRNA和28SrRNA基因组之间的基因间转录间隔区（intergenic transcribed spacerregions，ITS1区、ITS2区），具有真菌种属间差异性，真菌感染尚不能适应临床的实际需要。因不同菌种之间对抗真菌药物的敏感性存在差异。因此如何在用引物扩增出靶DNA后进一步鉴定至种成为关键问题。本研究探讨PCR结合DNA测序技术检测真菌性角膜炎的临床应用价值。
方法 应用半巢式PCR扩增ITS2/5.8SrRNA区域来检测标准真菌菌株和15例临床疑诊真菌性角膜炎患者角膜刮片中的真菌DNA。结果与涂片镜检和真菌培养的诊断阳性率相比较。另外，在第一轮扩增中，同时检测标本中的真菌和细菌DNA，以确定是否合并细菌感染。
结果 应用半巢式PCR技术所有标准真菌和12例临床疑诊真菌性角膜炎的角膜刮片中真菌检测均为阳性，但是标准细菌和正常人共耗时5小时。DNA测序确定菌种。敏感性为75%，真菌培养敏感性为86.6%；镜检敏感性为40%。通过孢子稀释法检测，MPCR和半巢式PCR的检测敏感度分别为5个孢子和一个茄病镰刀菌孢子。DNA测序后确定了菌种。
结论 扩增ITS2/5.8SrRNA的半巢式PCR及DNA序列分析技术是一种快速、敏感、特异、可靠的诊断真菌性角膜炎的实验室方法，为后续的临床治疗打下了良好的基础，具有良好的临床应用前景。