目的  建立以3T3为滋养层体外扩增人和大鼠角膜内皮细胞的方法。

方法  机械分离人角巩缘、周边角膜、中央角膜位置的角膜后弹力层，经Collagenase I消化后，以丝裂霉素C处理的小鼠成纤维细胞3T3作为滋养层，分别使用未添加和添加bFGF的SHEM培养基进行培养，通过倒置显微镜和免疫荧光检测角膜内皮细胞生长状态和角膜内皮相关基因ZO-1、Cx43、9.3.E、ATPase以及神经细胞相关基因Musashi-1、NF-200、GFAP的表达状况；以相同方法分离培养EGFP转基因大鼠角膜内皮细胞，通过dispaseII消化分离两种不同形态的P0代内皮细胞，将对dispaseII敏感性不同的两种细胞分别以3T3细胞作为滋养层进行培养，通过倒置荧光显微镜观察记录两种细胞的生长状态的差别。

结果  不同位置的人角膜内皮细胞在3T3滋养层上都可以扩增，扩增能力以角巩缘内皮细胞最强，周边角膜内皮细胞次之，中央角膜内皮细胞最差；与正常的SHEM培养基相比，使用添加了bFGF的培养基可诱导角巩缘和中央角膜内皮细胞形态发生类似神经纤维样改变，免疫荧光染色也显示人角膜内皮可表达神经特异性基因Musashi-1、NF-200、GFAP，而周边角膜的内皮细胞则表现出bFGF抗性，仍维持正常内皮细胞形态；原代培养于3T3滋养层上的大鼠角膜内皮细胞出现两种不同表型，一种是边缘整齐，细胞排列紧密，类似细胞“克隆”的内皮细胞岛，另一种是细胞呈梭形，排列松散并侵入3T3细胞的细胞群；用dispaseII消化这两种内皮细胞，前者对DispaseII敏感，可以从培养皿上消化下来，传代之后仍然保持良好的内皮细胞的形态，而后者对DispaseII不敏感，难以从培养皿上消化下来。

结论  使用3T3作滋养层，SHEM为培养基可以对人及大鼠的角膜内皮细胞进行体外扩增；不同位置的人的角膜内皮细胞在3T3滋养层上的扩增能力为角膜缘内皮细胞>周边角膜内皮细胞>中央角膜内皮细胞；bFGF可诱导人角膜内皮细胞发生向神经细胞方向的转化；培养于3T3滋养层上的周边角膜内皮细胞可以抑制bFGF的诱导作用，维持内皮细胞的形态；使用DispaseII选择性消化内皮细胞可以维持角膜内皮细胞的表型。