目的 构建并筛选靶向大鼠结缔组织生长因子(CTGF)的shRNA表达载体

方法 根据Genebank中人CTGF mRNA序列，利用在线靶位点筛选并设计3个siRNA序列（R1/siRNA、R2/siRNA、R3/siRNA）利用一步PCR法产生包含U6启动子的短发夹RNA表达盒技术快速筛选高效siRNA，PCR法制备的shRNA表达盒（R1/shRNA, R2/shRNA, R3/shRNA）, 然后以脂质体转染试剂将shRAN表达框转染至人胚胎眼Tenon’s囊成纤维细胞，通过RT-PCR和Western Blot技术对成功构建的3个shRNA表达框进行有效性筛选,分析其CTGF mRNA及蛋白表达水平。将筛选得到的R3/siRNA克隆到pEGFP质粒表达载体，同时将筛选得到R3/siRNA克隆到慢病毒表达载体，包装重组慢病毒。经PCR和酶切鉴定证明pEGFP-CTGF-shRNA重组质粒和pGCL-CTGF-shRNA重组慢病毒载体构建成功。

结果 转染入R2/siRNA、R3/siRNA位点的siRNA片断组的CTGF基因mRNA和蛋白表达水平较对照组明显减弱，R3/siRNA位点抑制能力最强，转染入R1/siRNA位点的siRNA片断检测CTGF基因的mRNA和蛋白表达水平较对照组无明显差别。经酶切和测序证实pEGFP-CTGF-shRNA重组质粒和pGCL-CTGF-shRNA重组慢病毒载体构建成功。

结论 针对CTGF基因序列设计的3段siRNA表达框架, R2/siRNA、R3/siRNA位点的siRNA片断能有效地抑制CTGF基因,并能有效抑制HFTF中CTGF mRNA和蛋白的表达，为利用RNA干扰技术从转录后水平抑制青光眼滤过手术后滤过道瘢痕化的有效途径。R3/siRNA成功构建pEGFP质粒载体和慢病毒载体。