目的 观察土槿皮乙酸(PAB)对体外培养的人眼Tenon’s囊成纤维细胞(HTCF)的增殖和凋亡的影响,并比较不同浓度及不同作用时间时,药物作用的强弱,寻求辅助治疗和预防青光眼滤过手术后复发的新途径。
方法 取材青光眼手术患者的结膜下Tenon’s囊组织,应用组织贴壁法进行成纤维细胞的体外培养,传代后选取第三或第四代细胞。1.正常Tenon’s囊成纤维细胞的鉴定:制备细胞爬片后对其进行HE染色,并用免疫组织化学SP法抗波形蛋白抗体、抗波形蛋白抗体进行细胞鉴定。2. MTT比色法检测土槿皮乙酸对HTCF增殖的影响:用0~160umol/L等不同浓度 PAB作用于体外培养的HTCF,12~96h等不同时间观察HTCF的增殖情况,并采用MTT比色法检测HTCF的生长活性。3.用免疫组织化学SP法检测bcl-2蛋白在HTCF中的表达情况及PAB对其表达的影响:用0~160umol/L 等不同浓度PAB作用于HTCF48h,用免疫组织化学SP法检测Bcl-2蛋白表达情况。
结果 1. 体外培养的HTCF,一般呈长梭形或三角形,胞核圆,居中,胞浆丰富,生长旺盛,呈放射状或编织状排列。2.用SP法染色HTCF,见波形蛋白表达呈阳性,角蛋白染色呈阴性。且波形蛋白的阳性表达位于胞浆内,与细胞长轴方向相同的棕黄色束状或者网状结。3.在4~60umol/LPAB作用12~72h,MTT法检测出PAB能显著抑制HTCF的增殖(P<0.05),呈剂量和时间依赖性。而当PAB浓度超过60 umol/L,抑制作用升高不明显(P>0.05)。当作用时间超过72h,抑制作用增加不明显,呈饱和效应动力学特征。4.当PAB浓度≥4umol/L作用48h,能抑制HTCF表达bcl-2,呈剂量依赖关系(P<0.05)。
结论 PAB能显著抑制体外培养的HTCF的增殖,且呈剂量和时间依赖性。PAB有望成为辅助治疗和预防青光眼滤过手术后复发的新型药物。