目的 探讨氧化损伤条件下,晶状体上皮细胞的钙蛋白酶II活性变化及对晶状体上皮细胞活性的影响。
方法 将永生性人晶状体上皮细胞系SRA01/04 分三组:A组:对照组、B组:萘醌组、C组:萘醌+E64D组。分12小时、24小时、36小时三个时间点,流式细胞仪分析细胞凋亡情况,荧光探针DCFH-DA法检测细胞中活性氧的变化,共聚焦显微镜观察与分析氧化损伤对细胞内钙的影响,免疫组化及Western blot法分析钙蛋白酶II在细胞内的分布与蛋白水平的表达,RT-PCR法检测钙蛋白酶II在m RNA水平的表达,Western blot法分析作为钙蛋白酶II的底物的αB晶状体蛋白的量变化,间接反应钙蛋白酶II的活性。
结果 三个时间点萘醌组及萘醌+E64D组晶状体上皮细胞的凋亡率均明显高于对照组,萘醌组晶状体上皮细胞的凋亡率明显高于萘醌+E64D组。活性氧水平除处理后的第12小时萘醌+E64D组细胞中活性氧水平与对照组无明显差别外,其他两个时间点萘醌组及萘醌+E64D组晶状体上皮细胞中活性氧的水平明显高于对照组,萘醌组晶状体上皮细胞中活性氧的水平明显高于萘醌+E64D组。钙离子水平除处理后的第12小时萘醌+E64D组细胞内的钙离子浓度与对照组无明显差别外,其他两个时间点萘醌组及萘醌+E64D组细胞内的钙离子浓度明显于对照组,而萘醌+E64D组细胞内的钙离子浓度略低于萘醌组。三个时间点钙蛋白酶II蛋白质及m RNA水平的表达量为萘醌组>萘醌+E64D组>对照组,差异具有统计学意义(p<0.01)。而αB晶状体蛋白的量的变化为对照组>萘醌+E64D组>萘醌组,差异具有统计学意义(p<0.01)。
结论 本研究进一步验证了萘醌对晶状体上皮细胞的氧化损伤在一定程度上与钙蛋白酶II表达量的增加及活性增强有关,而钙蛋白酶抑制剂E64D对这种损伤具有一定的保护作用。 |