目的 非侵入活体状态下的体内研究可以实时、动态、直观地显示研究对象的真实生物学信息，双光子激光扫描显微镜采用飞秒激光做光源，具有组织穿透力强、光漂白和光毒性小的优点，特别适合活细胞、活组织或活体体内的实时、动态跟踪研究。对于真菌性角膜炎小鼠角膜的活体体内的立体影像，至今还有没有研究报道。本研究利用角膜组织不同细胞和组织的光学特性，采用双光子荧光成像技术和二次谐波成像技术，对真菌性角膜炎小鼠角膜进行了活体体内、非侵入、立体形态学观察，为深入了解真菌性角膜炎的病理变化打下基础。
方法 主要仪器有德国Zeiss公司的LSM 780 NLO双光子激光扫描显微镜，美国相干公司的飞秒脉冲激光器。显微镜设置为：物镜为共聚焦专用20X浸入式水镜（NA 1.0）、3个反射非扫描检测器（Non Descanned Detection，NDD）滤光片设置分别为：R1（LP 555；BP 565-610）、R2（mirror；BP 380-430）、R3（mirror；BP 500-550），飞秒激光波长为800nm。C57BL/6N正常对照小鼠和真菌接种后24小鼠分别麻醉、固定后，暴露眼球，采用上述设置进行扫描，获取图像资料，利用Zeiss Zen 2010图像分析软件进行处理、分析。
结果 用800nm波长的飞秒激发激发，用反射光NDD接受荧光和二次谐波信号，小鼠麻醉状态下角膜原位可以得到清晰的真菌性角膜炎的角膜立体图像。主要结果如下：1）正常小鼠通过瞳孔，可以检测到角膜、房水和晶体组织，得到了这些部位的组织结构和细胞形态学的立体资料。2）可以清楚地检测到真菌、角膜上皮细胞、角膜基质细胞、角膜基质内的胶原结构，上皮下神经和血管影像。3）真菌周围，角膜固有细胞和胶原组织被破坏，胶原结构紊乱，炎症细胞包围，真菌周围组织呈现鞘样、隧道样结构；4）创伤部位有角膜上皮细胞填充的填充现象，真菌周围有角膜基质的激惹现象。
结论 采用双光子激光扫描显微镜，利用荧光成像技术和二次谐波成像技术，不但可以清楚地对小鼠眼前节结构进行三维立体显示，还可以清晰显示病变部位的组织、甚至细胞的微细的立体结构。通过对真菌性角膜炎小鼠角膜进行活体体内形态观察，可以清晰显示真菌性角膜炎病理状态下真菌、角膜固有细胞、胶原以及炎症细胞相互作用的立体图像，该方法是一种新的、活体体内、非创伤成像方法，对动态研究眼前节的病理以及病理变化提供了一些有意义的资料。