| 目的 构建针对TGFβ2特异性dsRNA质粒载体，并研究其对体外培养的结膜囊成纤维细胞TGFβ2 mRNA表达的影响。
方法
通过Genebank查找TGFβ1 mRNA序列，在以往筛选的基础上，设计和合成2条互补64bpDNA单链，并将其合成双链；利用pSilencer TM hygro质粒构建TGFβ2特异性dsRNA载体。载体构建成功后转染感受态大肠杆菌进行培养，抽提质粒，并作测序和纯化处理。将体外培养的大鼠结膜囊成纤维细胞分为4组，即TGFβ2特异性dsRNA质粒载体组、空白质粒载体组、MMC组和正常对照组。其中
将TGFβ2特异性dsRNA质粒和空白质粒通过LipofectinTMReagent2000包装后分别转染TGFβ2特异性dsRNA质粒载体组和空白质粒载体组的结膜囊成纤维细胞；MMC组的结膜囊成纤维细胞，利用浓度为0.4mg/ml MMC处理5分钟；空白对照组未行任何处理。处理48小时后，提取上述4组细胞的总RNA，并利用RT-PCR对各组TGFβ2 mRNA表达情况进行检测。
结果
测序结果显示所构建的TGFβ2特异性dsRNA质粒载体中部分序列与所设计的64bpDNA序列完全一致；RT-PCR结果显示，MMC组TGFβ2mRNA表达量最低，TGFβ2特异性dsRNA质粒载体组次之，上述2组所得数据经统计学处理与空白载体组和正常对照组之间具有显著性差异。
结论
可以利用pSilencer TM hygro质粒构建针对TGFβ2特异性dsRNA载体，并且所构建的特异性载体能够抑制结膜囊成纤维细胞TGFβ2 mRNA的表达。本研究结果首次提示可利用dsRNA来干预结膜囊成纤维细胞TGFβ2mRNA的表达，这可能会为临床青光眼术后结膜滤过泡瘢痕化的防治提供一种新的方法和思路。 |
