| 目的：建立人眼脉络膜血管内皮细胞培养方法，为研究与人眼脉络膜血管内皮细胞有关眼部疾病，尤其为研究脉络膜新生血管性疾病提供体外研究模型；方法：1. 采用胰酶、胶原酶对人眼脉络膜组织块进行两步消化，应用免疫磁珠CD31Dynabeads对消化后的细胞混合悬液分选纯化，合理地使用适宜于血管内皮细胞生长的培养基和培养器皿，培养人眼脉络膜血管内皮细胞；2. 采用形态学观察、透射电子显微镜观察、内皮细胞特异标志FⅧ因子、CD31、CD34的免疫组化染色观察的方法对培养的人眼脉络膜血管内皮细胞进行了鉴定；结果：1. 经胰蛋白酶和胶原酶消化联合CD31Dynabeads分离纯化后接种于培养瓶的人眼脉络膜血管内皮细胞呈小簇状聚集；36小时后细胞贴壁，3~7天细胞分裂、生长，形成小的细胞群；各小片细胞逐渐生长并相互连成大片，约2~3周细胞长满培养瓶底面。原代培养的细胞开始呈细长的形状，成片生长的细胞呈多边形、类圆形，细胞群融合后呈铺路石样外观，细胞表面可见有较多的磁珠吸附，但对细胞的生长未见有影响，随反复换液，磁珠渐渐减少。细胞长满培养瓶底面可见接触抑制现象。传代培养次日常可见有较多的血管内皮细胞死亡，漂浮在培养液中，传代后的细胞保持圆形或多边形，融合成单层时呈鹅卵石样排列，细胞表面吸附的磁珠明显减少，传代后约1周细胞可长满培养瓶底面需再次传代。2. 原代培养的人眼脉络膜微血管内皮开始呈细长形生长，成群生长的细胞呈多边形、类圆形，细胞群融合后呈典型的铺路石样外观。细胞长满培养瓶底面可见接触抑制现象。透射电镜下，人眼脉络膜血管内皮细胞胞浆内可见少数的长杆状、圆形单位膜包绕细管构成的涡状Weibel-Palade小体，有较多的线粒体、高尔基氏体，胞浆内有较多的空泡。培养的人眼脉络膜血管内皮细胞经FⅧ因子相关抗原、CD31、CD34免疫组织化学染色95%以上的细胞呈阳性反应——棕褐色着色，阴性对照未见着色。结论：本实验研究在国内首次成功地进行了人眼脉络膜血管内皮细胞培养，经形态学观察、透射电子显微镜观察、内皮细胞特异标志FⅧ因子、CD31、CD34的免疫组化染色观察鉴定为血管内皮细胞，纯度较高，方法易行，可获得足够实验研究的细胞数量。 |
