| 目的：探讨人角膜缘上皮细胞（corneal limbal epithelial cells, CLECs）体外分离、纯化、建系条件，为角膜病的基础研究提供细胞模型，为细胞治疗和生物角膜的构建提供种子细胞。
方法：1. CLECs的培养建系：培养液采用SMEM基础培养液，添加15％胎牛血清，生长因子等成分。用细胞消化法、组织块培养法、饲养层培养法培养原代CLECs。细胞达到80％融合后，进行细胞消化、传代。2.检查、鉴定： 传代细胞行光镜检查、电镜检查细胞的生长特性。免疫组化和Western blot检测细胞CK3、P63、PCNA、FN、LN蛋白表达。同时绘制第26代CLECs细胞生长曲线。第30代CLECs接种到裸小鼠颈背部皮下观察细胞的致瘤性。第36代CLECs进行染色体检查，观察细胞染色体数目和核型的变化。
结果：⑴光镜观察：利用三种方法培养出的原代CLECs具有较高的增殖能力和相对低的分化程度。光镜下观察：大部分原代CLECs比较小，细胞多呈圆形或多边形，排列紧密；细胞现在已经传到38代，细胞形态成卵圆形、多边形。⑵电镜观察：原代和第30代细胞表面可见许多微绒毛，核染色深，核仁大而明显，原代细胞核/浆比大，后代细胞核/浆比减少。⑶蛋白表达检测：免疫组化结果表明原代细胞P63（＋），AE5（＋），PCNA（＋），FN和LN弱阳性表达。随着传代次数的增加，细胞AE5阳性率逐渐增加，P63阳性率下降， PCNA在传代细胞中始终有强表达，后代细胞FN和LN无表达。0、26、36代细胞Western blot鉴定表明：CK3、PCNA在三代细胞均有表达，P63在0代表达。⑷细胞增殖曲线：第26代CLECs传代后第2-4天，细胞处于对数生长期，第4-5天处于平台期，第6天细胞由于接触抑制，细胞进入衰退期。⑸细胞致瘤性：10只裸小鼠颈背部接种第30代CLECs后80天，肉眼观察未见有肿瘤生长，大体解剖和组织切片未见肿瘤生长。⑹染色体检查：第36代CLECs为多倍体、异倍体细胞，染色体的数目从44到83条不等，可见正常的Y染色体。多数染色体发生断裂、重排。
结论：1. 采用消化法、组织块培养法、饲养层培养法培养原代CLECs增殖能力强，分化程度低。2. 原代CLECs在体外成功传到38代后，细胞仍保持较高的增殖能力和表达角膜上皮细胞的特异性蛋白（CK3），细胞无成瘤性。细胞的染色体数目和核型发生了变化。
﹡本研究受国家重点基础研究发展规划项目973子课题（G1999054309-6）、国家高技术研究发展计划（863计划）（2003AA205050）、广东省科技计划项目:组织工程重大专项（A302020101）、广东省科技计划项目（2003A3020401）、教育部博士点基金（20030558074）。 |
