| 目的: 应用转基因技术体外培养稳定表达人内皮抑素的视网膜色素上皮细胞（RPE），为脉络膜新生血管的基因治疗奠定基础。方法: 采用人内皮抑素真核表达载体 pSecTagA-h内皮抑素，应用电转移法及脂质体介导法转染Brown Norway（BN）大鼠RPE细胞，以Zeocin筛选出表达内皮抑素的RPE细胞，传代培养3周。观察指标：1）转染后提取RPE细胞总DNA进行PCR，产物进行琼脂糖凝胶电泳；2）原位杂交、western bloting和免疫组化，分别在转录和翻译水平观察内皮抑素在转染RPE细胞中的表达情况；3）ELISA法检测转染RPE细胞培养上清中内皮抑素的表达水平；4）MTT测定所表达内皮抑素蛋白活性。结果: PCR检测结果表明转染后的RPE细胞总DNA中存在长度为550bp左右的特异性条带； 原位杂交，免疫组化观察到大量RPE细胞表达内皮抑素 mRNA及内皮抑素蛋白；western bloting 显示， RPE细胞培养上清中有内皮抑素阳性条带；ELISA法检测到转染后3、5、7、10、14、20天6个时间点培养上清内皮抑素蛋白表达量分别为321.5±41.0 ng/ml，162.5±23.45ng/ml，78 ±11.22ng/ml， 78±9.87 ng/ml， 78±10.06 ng/ml， 78±12.67ng/ml；MTT显示，培养上清中内皮抑素能够抑制ECV304的增殖，IC50为45.68ug/ml,对RPE细胞、K562的生长无影响；结论: 经电转移法及脂质体介导转染法获得体外培养稳定表达内皮抑素的RPE细胞是可行的，转染成功的RPE细胞能够稳定表达内皮抑素蛋白，所表达的内皮抑素蛋白具有生物活性。 |
