目的 本研究探讨Rb细胞系WERI-Rb1肿瘤干细胞的分离、培养、扩增方法，探讨其干细胞特性及视网膜前体细胞特性，研究靶向诱导Rb肿瘤干细胞分化为视网膜神经元的策略。
方法 1. 体外培养Rb基因纯合缺失的视网膜母细胞瘤细胞系WERI-Rb1，应用流式细胞仪UV荧光激活细胞分选法检测其旁群（SP）细胞比例；应用流式细胞仪检测法分析肿瘤干细胞标记物CD133的表达情况；使用含bFGF及EGF的无血清化学限定培养基（SFM）对WERI-Rb1中的肿瘤干细胞（SLCCs）进行分离培养。2. Rb肿瘤干细胞特性鉴定：有限稀释法检测SLCCs的单细胞克隆形成能力， 检测SLCCs中Nanog、Oct3/4、Musashi-1等干细胞相关基因及蛋白的表达。3. Rb视网膜前体细胞特性鉴定：检测WERI-Rb1 及SLCCs中视网膜早期发育相关Chx、Pax6、 Rx、 Nestin、 CD133及 Lhx2基因及蛋白的表达。4. 培养液中添加诱导因子Dkk-1及Lefty-A诱导SLCCs分化为视网膜神经元。5. 过表达Math5基因诱导SLCCs分化为RCGs。
结果 1. Rb细胞系WERI-Rb1中SP细胞比例为0.075±0.017%。应用SFM法分离培养前后WERI-Rb1中CD133的比例为69.77±1.39% 及99.03±0.15%。2. SFM法分离培养后细胞克隆形成能力明显高于分离培养前，SLCCs表达干细胞相关标记物Nanog、Oct3/4、Musashi-1的基因及蛋白。3. SLCCs表达神经或视网膜早期发育相关基因及蛋白Chx、Pax6、 Rx、 Nestin、 CD133及 Lhx2。4. 诱导因子Dkk-1及Lefty- A可诱导SLCCs向视网膜神经元分化，表达神经胶质细胞标记蛋白GFAP及感光细胞标记蛋白Rhodopsin，其机制可能为通过上调视网膜前体细胞相关基因实现。5. 过表达Math5可诱导SLCCs向RGCs分化，上调表达Brn3b，Islet-1及Synaptophysin。
结论 视网膜母细胞瘤细胞系WERI-Rb1具有肿瘤干细胞特性及视网膜前体细胞特性，在一定诱导因子作用下，可定向分化为视网膜神经元。下一步研究将通过改变细胞表观遗传学决定簇，去除其成瘤性，从而为干细胞替代治疗的种子细胞来源提供新的解决方案。 |
