目的 Smad4是TGF一信号转导中的核心枢纽分子，它与受体依赖的Smads结合调节下游靶基因的表达。本研究的目的是利用Cre/LoxP系统建立眼组织特异性Smad4基因敲除小鼠并进行初步表型分析。
方法 本研究选择了PAX6第一启动子P0驱动的晶体外胚层特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠(Le-Cre)作为介导敲除的工具鼠，将其与Smad4条件基因小鼠（Smad4fl/fl）交配至获得Le-Cre特异性Smad4基因敲除小鼠或变异小鼠（Le-Cre；Smad4fl/fl)(如图1）。为了证实条件性基因敲除的特异性及有效性，通过PCR技术对小鼠或鼠胚进行了相关基因分析（Le-Cre, Smad4, ROSA)，特定组织绿色荧光蛋白(间接检测Le-Cre)的表达及Smad4蛋白检测，同时利用ROSA26报导基因小鼠与Le-Cre转基因小鼠交配获得LeCre；Rosa26双转基因小鼠，通过LacZ染色显示Le-Cre在眼组织的表达；通过免疫组化技术检测野生小鼠和变异小鼠眼组织Smad4蛋白的表达；并对Smad4变异小鼠的表型进行了观察。
结果 早在E10.0天左右，鼠胚晶状体位置及眼周外胚层发现强荧光的GFP表达（图2 A-D），表明Le-Cre明确出现在特定的靶组织。通过小鼠基因型分析，确定了小鼠或鼠胚是否携带Cre重组酶基因、Smad4条件性等位基因和/或Rosa报导基因（图2E,F,G)，对小鼠晶体DNA的基因分析也证实Smad4基因在某些特异性组织内得到剔除(图2H)。通过在Cre转基因小鼠导入报导基因，并籍LacZ染色对Cre重组酶的表达进行检测，显示了Cre重组酶的时空表达及其表达的组织特异性（图3）。Smad4免疫组化染色显示，在正常发育胚鼠眼可见广泛的Smad4表达，早期主要存在于胞浆，随着胚眼发育向核内转移（图4）；而在Smad4变异鼠胚眼，结果表明Smad4在Cre重组酶所表达的组织内缺乏表达（图5）。观察发现Smad4变异鼠可以顺利存活，但表现出眼球缩小、眼窝凹陷、眼睑畸形开放、闭合不能及眼周毛发脱失的外观（图6）。
结论 我们通过基因和蛋白水平的检测证实了Le-Cre;Smad4基因敲除鼠的建立及Smad4在变异小鼠中表达的缺乏。Smad4在眼组织的敲除导致了眼及附属器的明显异常，为深入了解眼球发育及Smad4对其影响的机制提供了一个可信的动物模型。