目的 本课题组的前期研究发现机械应力（MS）能促进人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19细胞株）分泌胶原，同时也显著影响RPE的糖代谢，但具体机制尚不明确。糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）是糖代谢中的关键酶，与皮肤纤维细胞的胶原合成相关，但是否涉及RPE的胶原合成则尚无报道。本研究拟采用双向调节实验、光学二次谐波成像技术（SHG）和代谢组学方法明确GSB-3β在MS诱导RPE胶原合成中的作用。
方法 1、细胞分组：将ARPE-19细胞株按20000个/cm2接种于胶原涂层组织培养皿。分为接受机械应力牵引组和对照组。培养28天后固定，并进行免疫荧光染色（anti-actin, anti-fibronectin和anti-α-smooth muscle actin）。2、分子生物学检测：在第7、14和28天取各组培养液，使用Western Blot检测GSK-3β的表达。3、双向干预实验：在ARPE-19中，加入GSK-3β的特异性拮抗剂SB216763（浓度分别为5μM、10μM和20μM）和激动剂Wortmannin（浓度分别为50nM、100nM和200nM）共同孵育。4、SHG检测：使用SHG激光共焦显微镜，在第14和28天对各组进行原位胶原含量的检测；在免疫染色后进行肌动蛋白检测；并分析三维结构。5、代谢组学检测：在第7、14和28天取各组培养液进行核磁共振氢谱检测和主成分分析。
结果 1、分子生物学检测：MS组中GSK-3β的表达水平明显下降（P<0.01），呈时间依赖性。2、双向干预实验：在干预后第14和28天，各SB216763组的胶原合成量明显高于其它组（P<0.01），呈剂量依赖性。同时各SB216763组的胶原层更厚，三维结构更致密，其细胞骨架的线应变和切应变也明显大于其它组。代谢组学分析显示各SB216763组培养液中的代谢产物含量较对照组发生明显变化，主要表现为糖酵解和糖异生减弱，三羧酸循环和糖原合成加强。PCA分析发现在各组之间，GSK-3β的浓度差异最明显。免疫荧光显示各SB216763组的anti-α-sma、anti-actin和anti-fibronectin染色明显强于对照组。
结论GSK-3β在机械应力诱导RPE胶原合成中起重要作用，抑制GSK-3β的表达能显著改变RPE的细胞代谢，并促进RPE的胶原合成。 |
