目的  研究高渗透压干预兔角膜上皮细胞活性氧的生成情况，探讨产生的活性氧对炎症及凋亡信号通路的调控作用。

方法  1.采用Dispase酶消化法原代培养兔角膜上皮细胞，并行细胞鉴定；2.荧光探针DCFH-DA和流式细胞仪检测高渗透压状态下细胞活性氧的产生，观察活性氧抑制剂的干预作用；3.测定高渗透压状态下细胞JNK、p-JNK、p-NF-κB、IL-1β、TNF-a的表达情况，观察活性氧抑制剂、JNK抑制剂和NF-κB抑制剂的干预作用；4.检测高渗透压干预下细胞CD95和CD95L的表达，TUNEL和Hoechst细胞凋亡荧光染色法观察高渗透压干预下细胞凋亡的形态学变化，观察活性氧抑制剂、JNK抑制剂的干预作用。

结果 1. Dispase酶消化法培养的兔角膜上皮细胞形态良好。免疫组化法鉴定可见培养的兔角膜上皮细胞染色阳性。2.高渗透压组活性氧荧光强度较正常渗透压组明显增强；与高渗透压组相比，加入活性氧抑制剂的高渗透压组的荧光强度均有降低。3. Western Blot检测显示与正常渗透压组相比，高渗透压组中P-JNK-2的表达明显增加；加入活性氧抑制剂的高渗透压组P-JNK-1和P-JNK-2的表达均明显下降；p-JNK、p-NF-κB、IL-1β和TNF-a的表达，高渗透压组较正常渗透压组明显增强；加入活性氧抑制剂的高渗透压组p-JNK的表达水平降低，加入JNK抑制剂的高渗透压组的p-NF-κB表达水平降低，加入NF-κB抑制剂的高渗透压组中的IL-1β和TNF-a的产生降低。4. Western Blot检测显示高渗透压组CD95和CD95L的表达较正常渗透压组增加；加入活性氧抑制剂、JNK抑制剂的高渗透压组中CD95表达减少，加入DPI的高渗透压组CD95L的表达减少，但是加入NAC、JNK抑制剂的高渗透压组CD95L的表达增加；高渗透压组细胞凋亡染色阳性率较正常渗透压组明显增加；加入活性氧抑制剂、JNK抑制剂的高渗透压组的细胞凋亡染色阳性率降低。

结论  Dispase酶消化法是一种有效的培养角膜上皮细胞的方法。高渗透压可以诱导兔角膜上皮细胞活性氧的生成增加，增加的活性氧继发调控下游炎症和凋亡信号通路，活性氧抑制剂可以逆转这种改变。