目的 本研究分离与扩增角膜缘基质微环境细胞，并证明这些基质细胞表达胚胎干细胞的标志物是支持角膜缘上皮干细胞未分化状态的必要条件。

方法 人角膜缘细胞分别用分散酶和胶原酶分离。在胚胎干细胞培养液中，分离的单个细胞分别种到包被、二维、三维Matrigel上，并用连续传代的方法扩增。同时我们选择含血清的培养液(SHEM、DMEM + 10% FBS)作为对照。干细胞标志物用实时定量PCR、免疫荧光染色、Western blot检测；干细胞克隆生长用3T3滋养细胞克隆形成率测定。

结果 分散酶可以分离完整的角膜上皮层，而胶原酶不仅分离角膜上皮层，而且分离到紧邻角膜上皮基底细胞的角膜基质细胞，免疫荧光染色显示这些细胞表达胚胎干细胞及其它一些干细胞标志物例如Oct4, Sox2, Nanog, Rex1, SSEA4, N-Cadherin, 和CD34。在三维Matrigel中，PCK+的上皮细胞与Vim+的基质细胞相结合形成球形体，细胞增殖缓慢；在包被的培养板以及二维Matrigel上，见大量的梭形细胞增殖。用胚胎干细胞培养液连续传代的时候，上述干细胞标志物逐渐减少，第四代细胞被种入三维Matrigel的时候，上述干细胞标志物又可以重新表达。对比其它培养液中分离的基质细胞，胚胎干细胞培养液中扩增的基质细胞与上皮细胞形成的球形体表达最多的上皮干细胞标志物p63a, 最少的分化标志物 CK12，在3T3细胞上形成最多的大克隆(Holoclone)。

结论 角膜缘微环境细胞可以被纯化、分离；这些基质细胞表达胚胎干细胞的标志物是支持角膜缘上皮干细胞的必要条件。这些细胞可以用来研究角膜上皮干细胞的微环境调控。