目的 探索在体外培养条件下，牛垂体提取物（Bovine Pituitary Extract, BPE）能否促进角膜基质细胞的体外增殖，并能维持静止态表型。

方法 进行体外培养前，每只日本大耳白兔都要进行活体激光扫描角膜共焦显微镜检查，观察并记录角膜基质层静止态基质细胞形态及数量。安乐死处死实验动物，获取角膜组织后机械去除后弹力层、内皮细胞及巩膜；采用DispaseⅡ酶液分离上皮层，继而使用复合型胶原酶充分消化角膜基质层，离心收集细胞。依据所选培养液不同，分为三组：BPE组K-SFM (Keratinocyte-serum free medium) + 50μg/ml BPE，FBS (Fetal Bovine Serum) 组K-SFM + 10%FBS，对照组采用K-SFM；分别加入三种培养液制成细胞悬液，以500个/cm²的细胞密度接种于培养皿中，相差显微镜下观察并记录三组细胞形态及生长变化。采用免疫荧光技术检测CD34和PCNA的表达，表达量采用平均荧光强度进行分析。BPE组进行传代培养，记录细胞形态及生长变化；采用免疫荧光技术检测CD34表达及F-actin分布。

结果 活体共焦显微镜示角膜基质层中可见明亮的角膜基质细胞核；前、后基质层中细胞平均密度分别为398±47个/mm²和232±23个/mm²。原代培养两周，BPE组细胞贴壁生长呈树突状，增殖融合后交织成网状；细胞传代培养至第三代，仍可见大量CD34表型阳性细胞，鬼笔环肽染色可见典型树突样结构。FBS组在培养早期细胞呈树突状，在血清刺激条件下，细胞形态逐渐转变为长梭形，增殖融合后形成致密细胞膜片。对照组细胞贴壁生长呈树突状，细胞增殖缓慢，未融合交织成网状或形成膜片。CD34表达检测：BPE组平均荧光强度为9.73±0.47，FBS组为0.56±0.05，K-SFM组为4.50±0.39，BPE组和对照组中静止状态的角膜基质细胞较少转变为成纤维细胞表型；PCNA表达检测：BPE组平均荧光强度为8.19±1.31，FBS组为12.27±0.73，K-SFM组为3.65±0.07，K-SFM组细胞增殖能力明显低于FBS组和BPE组。

结论 在体外培养条件下，添加BPE的无血清培养液能显著提高角膜基质细胞的增殖能力，并有效维持角膜基质细胞的静止态表型，从而为组织工程构建角膜基质层提供充足的种子细胞。