| 目的 ：通过EffecteneTM脂质体介导将自行构建的人血小板源性生长因子基因B(PDGF-B)真核表达载体（pcDNA4-PDGF-B）转染到体外培养的猫角膜内皮细胞中，证明人PDGF-B基因不仅能在体外培养的猫角膜内皮细胞中得以表达并具有促进该细胞分裂再生的作用，为人角膜内皮病的基因治疗提供依据。方法 ：一、采用逆转录聚合酶链反应从健康产妇胎盘mRNA中扩增出PDGF-B基因片段，并连接于pcDNA4B真核表达载体上，构建重组真核表达载体pcDNA4-PDGF-B， 转入JM109大肠杆菌感受态细胞，筛选、酶切鉴定及计算机自动序列分析证明该基因为目的基因。二、组织块培养法简捷、快速体外培养出纯净的猫角膜内皮细胞单层，通过细胞形态学观察、神经特异性烯醇化酶（NSE）单克隆抗体免疫组织化学染色及扫描和透射电镜观察鉴定细胞的种类及纯度。三、通过EffecteneTM脂质体介导将自行构建的人血小板源性生长因子基因B真核表达载体（pcDNA4-PDGF-B）转染到体外培养的猫角膜内皮细胞中，转基因后48小时通过报道基因pcDNA4-β-lacZ的表达来确定转染效率，通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及人PDGF-B单克隆抗体的免疫组织化学染色方法分别在基因水平和蛋白水平检测目的基因在该细胞中的瞬时表达情况。四、转基因后48-96小时间测猫角膜内皮细胞的MTT值，流式细胞仪测定处于G1期的细胞比例，制作体外培养猫角膜内皮细胞的定量损伤模型，统计学分析转染人PDGF-B基因对猫角膜内皮细胞DNA合成的影响和对猫角膜内皮细胞定量损伤后愈合的影响。结果 ：一、从健康产妇胎盘组织中能克隆出人PDGF-B基因，经计算机自动测序证明所克隆基因与基因文库中报道的人PDGF-B基因序列一致。二、组织块法行猫角膜内皮细胞的体外培养简单、方便，可形成完整纯净的细胞单层，经形态学观察、NSE的免疫组织化学染色及透射和扫描电镜观察证明为纯净的猫角膜内皮细胞单层。三、EffecteneTM脂质体可介导重组真核表达载体(pcDNA4-PDGF-B)转染体外培养的猫角膜内皮细胞，转染效率为11.3% ，RT-PCR表明人PDGF-B基因在猫角膜内皮细胞中能够得以表达，统计学分析证明转染人PDGF-B基因后的猫角膜内皮细胞中PDGF-B基因的DNA表达量明显提高，而单纯脂质体转染组人PDGF-B基因的瞬时表达无提高，人PDGF-B单克隆抗体免疫组织化学染色在人PDGF-B基因转染组见深染细胞，其余各组细胞人PDGF-B单克隆抗体免疫组织化学染色为均匀淡染。四、转染PDGF-B基因后48－96小时，猫角膜内皮细胞的MTT值，流式细胞仪测定的G1期细胞比例及猫角膜内皮细胞定量损伤后的愈合情况，经SPSS10.0软件包中聚类分析组间联结方法行统计学分析处理，重组质粒pcDNA4-PDGF-B转染组与其他三组非同组资料，PDGF-B的转染促进了体外培养的猫角膜内皮细胞的能量代谢和有丝分裂，而单纯脂质体转染组与未经转染的细胞组归为同组资料，说明PDGF-B基因可在体外培养的猫角膜内皮细胞中发挥其促进细胞分裂再生的作用，同时也证明脂质体对体外培养的猫角膜内皮细胞没有毒性作用。结论： EffecteneTM脂质体可介导人PDGF-B基因转染体外培养的猫角膜内皮细胞，该基因可在猫角膜内皮细胞中长期、稳定表达并促进该细胞的分裂再生，为下一步“转基因角膜内皮细胞的载体移植”的研究奠定基础，为临床解决“人角膜内皮细胞不能再生”的难题提供新思路。 |
