| 目的：通过兔角膜内皮细胞培养条件的探索及其在无血清条件下的生长状况研究为将来进行无血清培养角膜内皮移植和角膜三维培养打下理论和实践基础。
方法：用后弹力层培养法培养兔角膜内皮细胞，取生长状态良好的传二代细胞做细胞生长曲线，比较不同无血清培养条件下（RPMI1640（含20ng/mlbFGF），1640/SFM（含20ng/mlbFGF），SFM（含20ng/mlbFGF））角膜内皮细胞生长的形态、状态和生长规律，同时进行MTT检测，寻找最适合角膜内皮生长的无血清培养条件，NSE染色证明角膜内皮的神经嵴来源。
结果：兔角膜后弹力层贴壁后3天左右即可长出内皮细胞，6-7天时角膜内皮生长最旺盛呈典型的多角形形态，此时适合传代。传代后细胞生长状态由传代的密度决定，密度高细胞生长速度快，反之则慢， 3-5天为细胞生长旺盛期，可进行再次传代。传二代细胞最适合用于实验。用传二代细胞按5000个/孔（96孔板）传代后做细胞生长曲线，三种培养液中（RPMI1640，SFM ，RPMI1640/SFM）细胞生长曲线均为换液后第一天细胞数下降，第二天细胞数回升，以后基本保持同一水平，到换液后第六天细胞数又有增长，其中SFM培养液组在第四天细胞数有所下降。MTT染色做组间生长状态比较无显著性差异。NSE组化染色细胞显示为弱阳性，加上内皮形态特征及取材过程证明其确为神经嵴来源的角膜内皮细胞。在三种无血清培养液中，RPMI1640中细胞形态呈长条状，SFM中为典型的多角形细胞，RPMI1640/SFM中兼有前两者的特点。
结论：用后弹力层培养法可成功实现兔角膜内皮细胞的原代和传代培养；按5000个/孔密度传代第二天细胞即可达到稳定水平；三种无血清培养液中细胞生长速度和密度无差别，因此无血清培养兔角膜内皮细胞可用RPMI1640培养液。 |
