| [摘要] 目的 观察增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）的视网膜下膜（subretinal membranes, SRM）中粘附分子（ICAM-1）及基质金属蛋白酶（MMP-2）的表达。方法 用免疫组织化学方法对15例复杂视网膜脱离行玻璃体切割术时剥离的视网膜下膜进行观察。结果 ICAM-1和MMP-2分别在10例和8例视网膜下膜中表达，二者同时在7例视网膜下膜中表达。结论 SRM中有ICAM-1和MMP-2的表达，提示二者在PVR的发生发展中有一定作用。
[关键词] 视网膜下膜 增生 粘附分子 金属基质蛋白酶 免疫组织化学
Immunohistochemical study of adhesion molecules and matrix metalloproteinases in human subretinal membranes
LiLin, YANGAnhuai, XINGXIqiao. Department of ophthalmology, Renmin Hospital, Wuhan University, Wuhan 430060, China.
[Abstract] Objective To investigate the expression of intercellular adhesion molecules-1 (ICAM-1) and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in subretinal membranes (SRM) of eyes with proliferative vitreoretinopathy (PVR). Methods Fifteen subretinal vitrectomy for retinal detachment complicated with PVR and observed by immunohistochemical examination. Results Expressions of ICAM-1 and MMP-2 were observed in 10 and 8 membranes respectively. Expression of both in 7 membrane. Conclusion ICAM-1 and MMP-2 are expressed in subretinal membranes of eyes with PVR. These results indicate that adhesion molecules and matrix metalloproteinase might be involved in the development of PVR.
[Key words] Subretinal membranes hyperplasia adhesionmolecules
matrix metalloproteinases immunohistochemistry
视网膜前膜（ERM）和视网膜下膜（SRM）是增生性玻璃体视网膜病变（PVR）的一种重要病理表现，是视网膜脱离手术失败的主要原因。有关ERM的研究国内外已有较多报道，但有关SRM的研究报道尚不多见，我们采用免疫组织化学方法对15例SRM中ICAM-1、MMP-2进行了初步观察。
1 资料与方法
1.1 标本来源和收集 2003年1月~2004年3月在我科确诊为视网膜脱离而行玻璃体手术的住院患者15例，年龄26~68岁（平均45岁），男性11例，女性4例。病史半年到3年不等（平均1年）。手术采用美国STORZ公司的玻璃体切割机，灌注液为眼用平衡盐液，手术过程中取出视网膜下膜组织，立即放入4%多聚甲醛中固定液中，4℃冰箱冷藏备用。
1.2 标本制备和免疫组织化学染色 15份SRM标本均按常规制作石蜡切片。常规清洁载皮片，将制成的5μm厚的切片贴附于用3-丙氨基三乙氧基硅烷（3-aminopropyl-triethoxysilane，APES）胶涂片的玻片上，37℃温室放置24h，在二甲苯及梯度酒精内依次脱蜡，用PBS洗3次，作免疫组织化学染色。所有切片先作HE染色，取光镜下结构完整的膜再切片进行免疫组织化学染色。采见辣根酶标记的链霉卵白素试剂盒（博士德生物工程有限公司）染色（SP法）：单克隆鼠抗人ICAM-1和单抗隆羊抗人MMP-2抗体用抗体稀释液稀释至1：25和1：75滴于标本上。4℃冰箱湿房过液，37℃恒温箱复温1h；用PBS洗3次；抗体稀释的生物素标记二抗，滴度1：150，滴于标本上。37℃恒温箱放置30min，用PBS洗3次后用1：150滴度的辣根酶标记的链酶卵素滴于标本上，37℃恒温箱放置30min，用PBS洗3次，用1：50的3,3-二氨基联苯胺（3,3-diaminbzidine,DAB）滴于标本上，室温下放置15min，显微镜下终止显色，充分冲洗，用苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。特异性第一抗体用PBS代替并平行染色作为阴性对照。
1.3 结果判定及统计学方法
以细胞膜出现棕黄色为阳性，所得数据用X2检验进行统计学处理。
2 结果
光镜下观察，下膜结构完整的膜中，各类细胞成片集中分布，可见视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium, RPE）较多，还有成纤维细胞样细胞及巨噬细胞样细胞及大量淋巴细胞（图1），胶原纤维和基质含量较多。免疫组织化学染色观察，ICAM-1和MMP-2在SRM中阳性表达主要位于细胞膜中，部分位于胞浆中，其阳性表达呈条索状，片状或弥散分布，弥漫着色（图2,3）。15份SRM标本中10例有ICAM-1表达，占66.7%，有8例有MMP-2表达，占53.3%，ICAM-1和MMP-2共同表达者有7例，占46.7%，不加第一抗体的阴性对照标本均无着色。
3 讨论
3.1 PVR因玻璃体及视网膜前后细胞广泛增殖而产生多方牵引，是导致视网膜脱离手术失败的主要原因。有关ERM已有较多报导，而SRM的报导较少，其临床表现及病理作用以往常不被人们所关注。随着玻璃体手术的广泛开展，这种增殖性玻璃体视网膜病变的特殊表现逐渐被人们所认识。视网膜下膜又称视网膜后膜、视网膜下线条，是视网膜外表面的细胞增殖性膜，是增殖性玻璃体视网膜病变的一部分，1989年被美国硅油研究组单独列为PVR分类中后部PVR的第3亚型[1]。常见于孔源性视网膜脱离和视网膜脱离术后，以及眼球穿孔伤，钝挫伤及白内障摘除术后，在以下几种情况也偶可见到：视网膜血管病如coats病、糖尿病性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞、视网膜后纤维增生性葡萄膜炎综合征、眼内肿瘤如虹膜和脉络膜黑色素瘤及早产儿视网膜病变。SRM主要细胞成分是视网膜色素上皮细胞，另外巨噬细胞、纤维细胞、纤维星状细胞、肌纤维母细胞也参与了膜的形成，多与前膜同时存在，大多数的报告100%的下膜伴有前膜，但发生率较前膜低。
3.2 粘附分子是存在于细胞表面，介异细胞与细胞之间或细胞与细胞外基质之间接触，粘附的糖蛋白，其种类繁多，分布广泛，主要归属于免疫球蛋白超家族、整合素家族、选择素家族、钙依赖素家族及尚未分类的粘附分子等5大家族。ICAM-1是免疫球蛋白超家族中最重要的一种，又名CD54，是分子量为70-120KD的跨膜糖蛋白，分子结构由5个细胞外免疫球蛋白样功能区，1个跨膜区和1个细胞内短尾组成，主要表达于炎症和免疫反应部位的活化淋巴细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、各种上皮细胞及成纤维细胞等表面[2]。其天然配体是白细胞整合素CD18家族的两个成员，即淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）和巨噬细胞分化抗原-1（Mac-1），ICAM-1与其配体的相互作用可介导淋巴细胞间，白细胞与内皮细胞间的粘附，参与机体的胚胎发育、炎症、免疫反应、血栓形成及肿瘤转移等重要的生理和病理过程[3]。ICAM-1在血管内皮细胞表达最强，特殊是淋巴结、扁桃体的血管内皮。白细胞介素-1（IL-1），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-r（IFN-r）等细胞因子刺激可使其表达增强。SRM中RPE细胞在有炎性因子刺激下可以移行，改变表型，呈现为具有多种免疫活性及分泌多种因子的细胞，如RPE在PVR中向巨噬细胞和成纤维细胞转化等。PVR的自然病程与组织损伤过程同样分为炎症期、增生期和瘢痕期。在炎症修复中均需借助病变组织细胞与血液循环中效应细胞的相互作用，这种作用一方面可以通过细胞因子来完成，另一方面则通过细胞粘附分子介导的细胞直接接触而实现。本研究结果ICAM在PVR的SRM中表达为66.7%，低于ICAM在PVR的ERM中90%的表达[4]，可能是SRM的产生较ERM的产生所需时间长，因此SRM中细胞成分减少而胶原纤维和基质含量增多的原因。
3.3 细胞外基质不仅是细胞的支架结构，在维持正常组织结构和功能、细胞生长和分化，炎症反应和伤口愈合等过程中占有非常重要的地位，而且能调控细胞迁移、增殖、粘附和基因表达。基质金属蛋白酶（MMPS）是一类锌离子依赖的蛋白水解酶，参与细胞外基质的降解。主要由成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、巨噬细胞、视网膜色素上皮细胞等合成和分泌。基质金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibtor of matrix metalloproteinases）, TIMPS是MMPS重要的抑制因子，二者的调节平衡在创伤修复、组织重建、血管和瘢痕形成以及肿瘤转移等疾病中起着重要作用，并参与角膜伤口愈合、青光眼、葡萄膜炎和玻璃体网膜病变等疾病的病理过程[5]。MMP-2是MMPS的一种，主要由结缔组织细胞以非活性酶原形成分泌，能降解明胶、IV型胶原、V型胶源和弹性蛋白的基质金属蛋白酶。MMP-2在正常视网膜中未见表达，而在PVR中的视网膜前膜和下膜中表达，因此可能是在孔源性视网膜脱离后的炎症反应和修复过程中产生的[6]。一般认为，孔源性视网膜脱离由于RPE细胞和巨噬细胞分泌的MMP-2能降解基底膜蛋白成分和玻璃体胶原，诱导RPE细胞从基底膜脱离，并使细胞易于通过基底膜迁移至玻璃体和视网膜面，同时通过降解细胞外基质产生细胞迁移的途径，迁移后激活的细胞产生新的细胞外基质，最终和增生的细胞一起形成视网膜增生膜[7]。本研究结果MMP-2在PVR的SRM中表达为53.3%，同文献报导的46.7%基本一致，而明显低于MMP2在PVR的SRM中78.3%的表达，可能是由于孔源性视网膜脱离后由RPE细胞和巨噬细胞所分泌的MMP-2优先进入视网膜玻璃体腔而后再通过破坏的血-视网膜屏障进入视网膜下[6]。
总之，PVR的产生是与眼内细胞增生有关的较为复杂的病理过程，有多种免疫因子参与，包括免疫细胞、细胞因子及细胞外基质，本研究中ICAM-1和MMP-2均在SRM中呈阳性表达，说明ICAM-1和MMP-2在PVR的发生发展中起了一定的作用，因此控制炎症减少细胞间粘附分子及抑制MMPS的活性，可能是治疗PVR的一个关键，因此进一步研究它们在SRM中产生的作用规律，及其调究因素可能为临床治疗PVR寻找到新的途径。
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