| [摘要] 目的：研究糖尿病大鼠视网膜病变(diabetic retinopathy ,DR)时血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)与蛋白质糖基化终末产物(AGEs)的关系。方法：建立糖尿病大鼠模型，随机分为正常对照组（M），糖尿病1月组（M1）、3月组（M3）、5月组(M5)。 分别在视网膜切片及视网膜血管铺片上行VEGF 原位杂交、免疫组化、并分别对动脉血清中AGEs含量变化进行观察。结果：①M1时VEGF无表达，M3时VEGF石腊切片有34%蛋白阳性表达。M5时视网膜铺片VEGFmRNA表达34%、56%蛋白表达，石腊切片有67%mRNA表达、89%蛋白表达；②M1与M相比AGEs增加但无统计学意义（P>0.05），而M3、M5与M相比明显增加,具有统计学意义（P<0.05,P<0.001）。结论：我们认为DR时AGEs含量增加与VEGF表达增强有关系。
[关键词] 糖尿病；视网膜病；血管内皮细胞生长因子；原位杂交；免疫组化；蛋白质糖基化终末产物；视网膜血管铺片
临床上我们观察到，血糖控制的好的患者，糖尿病性视网膜病变的发病率低，尤其是早期的血糖控制，比较关键，那么高血糖是通过什么机制对糖尿糖视网膜病变（DR）起作用的呢？人们认为是晚期糖基化终末产物(advanced glycation endproducts,AGEs)所致，而血管内皮生长因子（VEGF）被公认是DR重要因子，那么AGEs与VEGF又有何关系尚未见报导，本文将VEGF与 AGEs在DR的作用进行研究，现报告如下。
一、材料与方法
1、糖尿病动物模型的建立及分组。
实验动物为体重180～200g雄性Wistar 大鼠55只，由本校实验动物部提供，全部动物均适应性饲养3天，饲料为本校动物部提供的大鼠标准饲料。选取其中45只随机分成三组：一个月组（M1）三个月组（M3）五个月组（M5），每组15只，腹腔注射链脲佐菌素（Streptozocin STZ)60mg/kg体重（溶于新配制的0.1M PH4.3柠檬酸钠缓冲液中),以诱发糖尿病,另外10只作为对照组(M)仅注射同样体积的柠檬酸缓冲液,注射STZ 3天后测尿糖及血糖,以尿糖++++以上,空腹血糖16.5mmol/L以上;尿量及饮水明显增多者列入糖尿病实验对象,实验期间大鼠正常饮食水,定期测血糖、尿糖及体重，每组有2只血糖恢复鼠作为STZ对视网膜毒性的观察，在实验结束前断尾测血糖，轻摘眼球，并在腹主Ａ取血留血清于-20°冰箱备测AGEs。
2．一般组织学处理：将部分眼球固定于10%中性福尔马林中48h，经乙醇常规脱水，二甲苯透明后浸腊包埋。连续4μm厚切片；用于HE及免疫组化染色，2μm切片用于PAS染色，6μm切片用于原位杂交染色。
3．视网膜血管消化铺片。
眼球福尔马林固定48h后去除眼前节成眼杯，桔瓣样将眼杯切成四块，分离出视网膜，流水冲洗24h，放入用0.1mol/L，PH7.8的Tris-HC1缓冲液溶解的3%胰蛋白酶溶液中，37℃温箱孵育2-4h,如仍消化不完全,则需要换新的消化液,当视网膜溶解后,将其移入蒸馏水中,轻轻振荡,将内界膜及残留的视网膜神经组织充分洗掉,仅剩一层透明的视网膜血管网,将其漂取并移至载玻片上,并展平,自然干燥,用于HE,PAS,免疫组化及原位杂交染色。整个过程均戴消毒手套操作。
4、VEGF原位杂交:
(1)制好的切片(6μm)从冰箱中取出，放置10分钟入二甲苯中脱蜡,二甲苯I和二甲苯Ⅱ中,共三小时(2)乙醇常规脱水:无水乙醇I 15sec→无水乙醇Ⅱ 15sec→95%乙醇II 15sec →90%乙醇I 15sec→90%乙醇II 15sec→80%乙醇15sec→70%乙醇15sec(3)PBS孵育1分钟(4)蛋白酶K(1μg/ml)每片滴加50μl ,37℃孵育15min(5)PBS冲洗1min(6)3%H2O2-蒸馏水阻断25min(7)PBS冲洗5min×3(8)0.2NHC1中和组织内碱性蛋白10min(9)PBS冲洗1min(10)脱水:70%乙醇15sec→90%乙醇15sec→95%乙醇15sec→无水乙醇15sec室温下自然干燥(11)将储存的杂交缓冲液在50℃下充分溶解,加入探针到所需浓度。(12)滴加VEGF探针20μl .用封孔膜将切片缠好,封闭,放入底部含有湿沙布的湿盒,42℃烤箱中孵育20小时。(13)同bFGF原位杂交(14)切片加入封闭液；室湿20分，不洗，直接滴加免抗地高辛，37℃,60分(15)滴加生物素化羊抗兔IgG,37℃，30分(16)滴加SABC-AP，37℃，30分(17)BCIP/NBT显色(18)水溶性封片剂封片，整个过程戴消毒手套。
5．免疫组化染色步骤：免疫组织化学染色采用链霉素抗生物素蛋白－过氧化物酶连接法(SP法)，其操作步骤如下：
（1）石蜡切片常规脱蜡经乙醇至水；（2）PBS冲洗5min;（3）3%H2O2-蒸馏水阻断内源性氧化物酶25min;（4）PBS冲洗5min×3;（5）将切片置入盛有抗原修复液的容器中，抗原修复液为0.01M PH=6.0的枸橼酸盐缓冲液(工作液),置炉上加热至温度达到92℃～98℃之间,保持5min关火,5min后从炉上移下,待温度冷却至70 ℃,入PBS冲洗5min×3; （6）加山羊血清（1:20）封闭30min；（7）倾去多余的血清，滴加适当稀释的特异性一抗于切片上，孵育40min或4℃冰箱过夜；（8）PBS冲洗5min×3;（9）根据一抗的不同滴加相应的二抗（IgG/Biotin），孵育40min;（10）PBS冲洗5min×3; （11）加相应的三抗（S－A/HRP）孵育40min;（12）PBS冲洗5min×3;（13）DAB－蒸馏水溶液显色，显微镜下观察，控制反应时间；（14）Mayer苏木精复染,二甲苯透明,中性树胶封片。
6．AGEs测定：
正常对照组（M），糖尿病1月组（M1）、3月组（M3）、5月组（M5）分别在腹主Ａ取血留血清于-20°冰箱备测AGEs。采用日本岛津公司生产的FR•540型荧光分光光度计测定AGEs,激发波长370nm，发射波长440nm，灵敏度１，狭缝10nm。
7、采用Instat统计软件包处理。
二、结 果
1、正常对照组（M）
原位杂交及免疫组化： VEGF的原位杂交及免疫组化均无阳性表达。
2、糖尿病一个月组（M1）
原位杂交及免疫组化： VEGFmRNA及蛋白均未见阳性表达。
3、糖尿病三个月组（M3）
VEGF原位杂交：视网膜铺片及石腊切片均为阴性。（照片6,7）
VEGF免疫组化：视网膜铺片未见明显的阳性表达，而石腊切片有3只在节细胞层尤其是内核层有阳性表达(34%)。（照片8,9,10,11）
4、糖尿病五个月组（M5）
VEGF原位杂交：视网膜铺片仅有3只mRNA表达在内皮细胞细胞浆及周细胞(34%)，石腊切片却有6只有mRNA表达(67%)。位于内界膜层、节细胞层、内核层、外核层及色素上皮层。位于内界膜的表达与GFAP免疫组化阳性分布相同。（照片19,20,21,22,23,24）
VEGF免疫组化：视网膜铺片有5只阳性表达(56%)，而石腊切片有8只强阳性表达(89%)，主要位于内核层、节细胞层的细胞及血管上。其中3只在睫状体上也有VEGF免疫组化阳性表达。且这3只与6只白内障虹膜血管扩张的大鼠相重叠。（照片25,26,27,28,29）
5、AGEs测定结果见表1
与正常组相比，M1增加但无统计学意义(P>0.05)，M3、M5均显著增多(分别P<0.05,P<0.01)
表Ⅱ：各组大鼠AGEs比较
AGEs
组别 眼数 X S
M 9 37.300 9.287
M1 9 55.289 6.937*
M3 9 69.400 4.003**
M5 9 90.511 6.780***
注：与M比较,*P>0.05 **P<0.05 ***P<0.001
三、讨 论
糖尿病性视网膜病变是糖尿病重要的微血管病变之一，其病理改变为视网膜毛细血管周细胞减少、微动脉瘤、毛细血管基底膜增厚，血-视网膜屏障破坏，毛细血管闭塞，视网膜缺血，导致新生血管形成及纤维增殖[1]。视网膜缺血诱导血管生长因子释放，是视网膜增殖性反应的启动因素，而VEGF能特异的作用与视网膜血管内皮细胞，促进其增殖及新生血管形成，在DR视网膜细胞增殖过程中具有重要作用。
蛋白质糖基化终末产物(AGEs)是指蛋白质、脂质或核酸等大分子在没有酶参与的条件下,自发地与葡萄糖或其它还原单糖反应所生成的稳定的产物。该反应过程称为非酶糖基化反应(也叫做Maillard反应)[2]。AGEs在内皮细胞、周细胞及基底膜沉积，诱导VEGF增多，VEGF通过提高血管通透性，促进内皮细胞增殖、迁移、血管形成，破坏血视网膜屏障、促进新生血管形成及增殖性病变；另外被AGEs诱导的VEGF可诱导细胞间粘连分子-1（ICAM-1）的表达，从而活化白细胞，后者在视网膜毛细血管的异常粘附和浸润，可阻塞视网膜毛细血管，并且活化的白细胞释放自由基及蛋白酶损伤周细胞和内皮细胞，影响血管通透性和自我调节功能[3]，从而导致DR的形成。
研究认为AGEs的形成是DR发病比较重要的一个机制，AGEs增加在DR的早期发病中就起作用，它主要作用是使蛋白糖基化，如血红蛋白糖基化则释放氧能力降低，基底膜的蛋白糖基化会造成基底膜增厚、通透性增加。因此本实验测定了大鼠AGEs含量，其结果显示，M1与M相比AGEs增加但无统计学意义（P>0.05），而M3、M5与M相比明显增加,具有统计学意义（P<0.05,P<0.001），这也证实了AGEs在DR发生中的作用。
我们在测定了AGEs同时，并进行了石蜡切片和视网膜铺片的VEGF原位杂交及免疫组化，其结果表明：M1时VEGF无表达，M3时VEGF石腊切片有34%蛋白阳性表达。M5时视网膜铺片VEGFmRNA表达34%、56%蛋白表达，石腊切片有67%mRNA表达、89%蛋白表达。VEGF的表达与AGEs含量增加基本相吻合,因此我们认为AGEs增加与VEGF相平行,M5表达最强,说明AGEs与VEGF的表达可呈正相关[4]。
另外，宋鄂研究表明电镜观察糖尿病1个月鼠视网膜可见到内皮细胞肿胀,管腔内明显的指状突起,核不规则,周细胞异染色质分布欠均。而糖尿病3个月和5个月鼠比糖尿病1个月鼠电镜改变明显，毛细血管基底膜增厚[5]。这与我们研究AGEs含量的变化相吻合。我们推测可能是由于AGEs的糖基化作用,始动了毛细血管基底膜的增厚[6],加重了缺氧,才引起电镜下的异常改变,出现了血管狭窄及闭塞,诱导了VEGF的表达。
参 考 文 献
1惠延年.眼科学.人民出版社，2005年1月第6版，174-175.
2 AM Stitt.The role of advanced glycation in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Exp Mol Pathol,Aug2003;75(1).
3 K Miyamoto and Y Ogura. Pathogenetic potential of leukocytes in diabetic retinopathy.Semin Ophthalmol,Dec 1999;14(4):
233-9.
4 Ikeda T. Nippon Ganka Gakkai Zasshi. The pathogenesis of vitreoretinal diseases from the standpoint of molecularbiology 2003 Dec;107(12):785-812.
5宋鄂、董宇，糖尿病大鼠视网膜血管铺片中碱性成纤维生长因子的表达与血管超微结构的改变。中华眼科杂志2004；40（5）339-342
6 Gardiner TA, Anderson HR, Stitt AW. Inhibition of advanced glycation end-products protects against retinal capillary basement membrane expansion during long-term diabetes.J Pathol. 2003 Oct;201(2):328-33.
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