| 目的：用5-CMFDA和EthD-1双重荧光染色法观察新鲜和冰冻保存兔角膜基质细胞的三维结构及细胞活性。
方法：对新鲜新西兰兔角膜和经过3个月冰冻保存的兔角膜各4只，用5-CMFDA和EthD-1进行双重荧光染色。染色后固定，30µm厚度切片，封片后用荧光显微镜观察细胞的三维结构及其活性。
结果：新鲜兔角膜标本经双重染色后，全角膜基质细胞的胞质及细胞突触均被5-CMFDA着染，发出高亮的绿色荧光，且边界清晰，与黑暗的胶原背景形成强烈对比；在水平方向和垂直方向角膜基质细胞都有突触互相连接，构成网络样结构，表明活细胞间存在着连接通道。新鲜兔角膜的前层基质细胞体积较小，密度约为47655±896个（细胞）/mm3,中层的基质细胞体积较大，突触长，密度约为36589±1014个（细胞）/mm3，后层的基质细胞体积最大，突触较短，密度约为29227±877个（细胞）/mm3，层间密度差异有显著性（p<0.05）。冰冻保存后的兔角膜经双重染色后，仅基质细胞的细胞核被EthD-1着染（呈红色荧光），而细胞质及细胞连接均不被5-CMFDA着染（无绿色荧光），表明经冰冻保存后基质细胞全部死亡。而冰冻保存后角膜基质细胞的数量与新鲜角膜比较无显著差异。
结论：5-CMFDA和EthD-1双重荧光染色可以在呈现角膜基质细胞及其突触较精细的三维结构的同时，提供明确的细胞活性依据。经冰冻保存处理后，角膜基质细胞全部死亡。 |
