| 目的 建立人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial, RPE）细胞的原代培养体系并传代。在阳离子脂质体介导下，将bak基因转入人RPE细胞中，希望通过诱导人RPE细胞凋亡来抑制其增殖，为增生性玻璃体视网膜病变的防治提供一种新思路。方法 1）采用消化法，从20－35岁意外死亡12小时内的供体眼中获取RPE细胞，以细胞密度5×104/ml接种于50ml培养瓶中，加入含20％新生小牛血清的DMEM/F12，置于370C、饱和湿度、5％CO2的培养箱中培养，1－3天换液一次。待原代细胞铺满融合后，按1：2－3传代。每日倒置相差显微镜观察细胞生长情况，取对数生长期细胞绘制细胞生长曲线。传至第三代时，通过细胞爬片，应用免疫组织化学的方法鉴定培养的细胞；2）构建bak基因的真核表达载体bak/pcDNA3，在阳离子脂质体Dosper介导下将bak/pcDNA3转染至人RPE细胞，用原位杂交法检测bak基因在人RPE细胞中的转染率，用免疫组化法检测bak蛋白在人PRE细胞中的表达；3）免疫组化法检测bcl－2和bak在转染后人RPE细胞中的表达；4）用TUNEL法和流式细胞仪检测bak基因诱导的人RPE细胞的凋亡；5）用细胞生长曲线、MTT法和Ki-67的表达来检测转染bak基因后，人RPE的增生活性。 结果 1）原代RPE细胞胞浆内见大量黑色素颗粒，细胞呈六边形。传代后细胞呈梭形或多边形，色素明显减少，至第三代已基本消失。抗人细胞角蛋白染色的阳性率几乎达100％。从细胞生长曲线可以看出，人RPE细胞的对数生长期在1－4天；2）转染bak基因后，原位杂交结果见转染后第3天阳性率最高，为68.4%，免疫组化结果见转染后第3天阳性率最高，为62.8%；3）转染bak基因后，人RPE细胞bcl－2的表达较转染前显著性降低；4）TUNEL法检测到转染后人RPE细胞的凋亡率为47.4%，流式细胞仪检测到转染后人RPE细胞的凋亡率为35.37%；4）细胞生长曲线和MTT法均可见转染bak基因后，人RPE细胞生长明显受抑制，转染后Ki-67的表达率为42.7%，较转染前显著性降低。 结论 1）体外培养的人RPE细胞具有与其在体相似的形态结构特征；2）阳离子脂质体Dosper能有效地将bak基因转染入人RPE细胞；3）bak基因能诱导人RPE 凋亡从而抑制其增生。 |
