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| 细胞凋亡在角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究 |
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作者：周善璧 … 文章来源：重庆医科大学附属第一医院眼科 400016 点击数：1070 更新时间：2006/6/26 22:45:43 
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| 免疫排斥反应是影响角膜移植预后的最主要因素，如何降低排斥反应的发生，提高移植成功率是手术开展进程中最迫切需要解决的问题
细胞凋亡参与同种器官移植免疫排斥反应的发生
本实验旨在全面，系统，深入地研究细胞凋亡发生机制在角膜移植免疫排斥反应的作用
实验设计思路：
建立研究的对象：诱导角膜移植免疫排斥反应的发生
建立模型：大鼠穿透性角膜移植模型
术后持续观察，判定排斥反应的发生
细胞凋亡的检测
组织形态学水平 TUNEL法；透射电镜观察
分子水平 检测凋亡相关蛋白
基因水平 检测凋亡相关基因
检测与凋亡相关的细胞因子表达水平
纵向比较
术后不同时期细胞因子的表达水平
与细胞凋亡程度相关性
横向比较
加入干预因素
干预组，对照组不同组别间细胞因子的表达水平
与细胞凋亡程度相关性
第一部分 大鼠角膜移植术后早期角膜基质细胞凋亡的实验研究
研究目的： 检测角膜移植术后早期角膜基质细胞凋亡的发生规律，探讨细胞凋亡机制在角膜局部损伤修复中发挥的作用。
实验方法：
建模：大鼠穿透性角膜移植模型
分为：异体移植组
自体移植组
取材: 术后24h，7d取术眼角膜植片
检测方法：
TUNEL法 植片周边区和中央区基质层细胞凋亡
透射电镜观察 凋亡细胞超微结构改变
结果：
1.实验各组术后24h角膜植片基质层可见凋亡细胞明显增多，基质层凋亡细胞主要存在于基质浅层，以周边区为主。术后7d凋亡的基质细胞数量明显减少。异体移植组与自体移植组比较，无显著性差异。
2. 角膜植片中基质细胞超微结构改变，细胞皱缩，胞浆浓缩，小泡形成，细胞膜完整，染色体集成核膜的致密团块，形成特征性凋亡小体。
讨 论：
对角膜创伤修复机制的研究中，提出细胞凋亡可能是角膜愈合反应的启动因素这一假说。 基质细胞凋亡，可诱发深层基质细胞移行，激活，重新分布，分泌刺激上皮增生和修复的信号，参与上皮，基质的修复。移植术后基质细胞凋亡的发生规律可用上述假说进行解释，推测术后早期细胞凋亡的发生主要是与局部角膜创伤修复有关。
目前临床上应用的以激光光学切削术为代表的近视治疗手段，其术后损伤修复过程中过度的愈合反应被认为是影响疗效的重要因素。
明确角膜浅层基质细胞的凋亡是角膜损伤修复的启动因素，临床上可以通过各种途径阻止基质细胞凋亡，可能有助于减少随后邻近基质细胞的激活和增殖，降低局部过度愈合反应发生率。
第二部分 Fas/FasL 及其介导的细胞凋亡在大鼠角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究
研究目的：
研究大鼠角膜移植免疫排斥反应过程中
角膜植片各层细胞凋亡的发生规律
凋亡调节蛋白Fas/FasL表达的变化规律
凋亡相关基因caspase-3mRNA表达的动态变化规律
探讨三者的相关性及在角膜移植免疫排斥反应中的作用
实验方法：
建模：大鼠穿透性角膜移植模型
取材:
术后观察术眼，判断移植免疫排斥反应的发生
术后3d，7d 排斥反应发生前
10d，14d 急性排斥反应期
21d，28d 排斥反应发生后 取术眼角膜标本
检测方法：
TUNEL法 植片上皮层，基质层，内皮层细胞凋亡情况
免疫组化法 植片Fas/FasL蛋白的表达
RT-PCR法 植片caspase-3 mRNA的表达
结果：
1.细胞凋亡情况
术后实验各组角膜植片上皮层，基质层及内皮层均可检测到细胞凋亡；自体移植组术后未发生免疫排斥反应，植片各层凋亡细胞的数量随时间逐渐减少；异体移植组在急性排斥反应期植片各层凋亡细胞的数量明显高于排斥反应前和排斥反应后。
2.Fas，FasL蛋白表达情况
术后实验各组角膜植片各层均出现Fas，FasL蛋白的表达；自体移植组术后Fas，FasL蛋白的表达水平逐渐降低；异体移植组在急性排斥反应期Fas蛋白的表达水平明显高于排斥前和排斥后；同种异体移植组在急性排斥反应期FasL蛋白的表达水平明显高于排斥前和排斥后。
3.Fas，FasL蛋白表达水平与细胞凋亡程度相关性分析
实验各组术后Fas，FasL蛋白的表达水平与角膜植片中细胞凋亡程度呈正相关。
4.caspase-3mRNA基因表达情况
实验各组角膜移植术后早期caspase-3mRNA的表达即可被检测出；同种异体移植组急性排斥反应期角膜植片caspase-3mRNA的表达达到高峰，排斥后2周仍处于较高表达；自体移植组角膜植片caspase-3mRNA表达水平随时间延长逐渐下降。
5.caspase-3mRNA基因表达水平与细胞凋亡程度相关性分析
实验各组术后不同时期caspase-3mRNA表达水平与细胞凋亡程度成正相关。
讨论：
细胞凋亡与角膜移植免疫
在未发生免疫排斥时 角膜表达的FasL与穿过物理屏障的Fas阳性淋巴细胞结合，诱导淋巴细胞凋亡， 维持免疫赦免。
在发生排斥反应的植片中 出现移植物实质细胞的凋亡，浸润的T细胞和巨噬细胞参与诱导凋亡过程。
本实验结果
与Larkin等的研究结果相符合 提示移植物细胞凋亡是角膜移植排斥反应中存在的重要组织形态学改变 证实细胞凋亡机制参与介导角膜移植排斥反应中角膜细胞的损伤。
Fas/FasL系统与角膜移植免疫
Fas/FasL系统参与角膜免疫赦免
Fas/FasL 系统可诱导激活的T淋巴细胞 凋亡，维持前房相关性免疫偏离；
角膜细胞表达的FasL可与新生血管内皮细胞表达的Fas结合，诱导血管内皮细胞发生凋亡，抑制新生血管的生长；
Fas/FasL系统与角膜免疫排斥
细胞毒T淋巴细胞（CTL）介导的细胞毒作用对移植物的损害是移植免疫排斥反应发生的主要原因，作用的发挥与Fas/FasL系统密切相关；
CTL可表达FasL与靶细胞表面Fas抗原结合，介导靶细胞凋亡；
存在于CTL上的FasL可引起CTL增生；
激活的CTL自身细胞表面FasL表达增高，Fas/FasL相互作用又促进CTL的激活，发挥正反馈效应。
本实验结果提示：
角膜移植术后局部微环境改变，Fas/FasL蛋白通过上皮-基质，基质-基质的旁分泌和自分泌途径表达增加，介导细胞凋亡并对凋亡进行调控。
在免疫排斥反应发生过程中，细胞毒T淋巴细胞（CTL）介导的细胞毒作用通过Fas/FasL系统引起移植物细胞的凋亡。
Caspase与角移植免疫排斥反应中细胞凋亡的发生
Caspase级联瀑布反应是完成细胞凋亡的最终途径
Caspase-3处于细胞凋亡的下游，是caspase家族中最重要的凋亡执行者 ，负责对全部或部分关键性蛋白的激活或灭活。
本实验结果提示
术后早期角膜创伤修复过程出现的细胞凋亡和角膜移植免疫排斥过程中出现的细胞凋亡，皆为caspase-3为关键效应子的caspase级联反应作用产生的结果 ；同时也从基因水平证实了细胞凋亡参与角膜免疫排斥反应中移植物损伤机制。
临床研究意义
拮抗caspase级联反应有可能在一定程度上阻止角膜移植排斥反应的发生和发展，对于临床的用药选择有相当大的实用价值；临床上应用合成的选择性的caspase阻断剂阻断凋亡；通过反义技术基因治疗手段将caspase的反义核酸导入细胞内封闭目的基因的表达，干预细胞凋亡的发生；但目前尚未有研究将其用于防治角膜移植免疫排斥反应的发生。
第三部分 白细胞介素-1β对角膜移植免疫排斥反应中细胞凋亡发生的影响的实验研究
研究目的：
研究白细胞介素-1β（IL-1β）在角膜移植免疫排斥反应过程中表达的动态变化规律；
白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1ra）对凋亡调节蛋白Fas/FasL 表达的影响，探讨IL-1β对于角膜移植免疫排斥反应中发生的细胞凋亡的作用。
实验方法：
建模：大鼠同种异体穿透性角膜移植模型
实验分组：
治疗Ⅰ组 50μg/mL IL-1ra点眼治疗
治疗Ⅱ组 100μg/mL IL-1ra点眼治疗
对照组 生理盐水点眼
术后观察 记录不同组植片的平均存活时间
取材 实验各组分别于排斥前，急性排斥期，排斥发生后2周
取角膜标本和房水标本
检测方法
双抗体夹心ELISA法 房水中IL-1β含量
免疫组织化学法 角膜植片Fas，FasL蛋白表达
结果：
角膜植片存活时间
IL-1rα治疗组角膜植片的存活时间明显长于生理盐水空白对照组，且成剂量相关。
IL-1β的含量
各实验组术后房水中IL-1β含量较正常对照组明显升高；
在急性排斥期IL-1β含量达到高峰，显著高于排斥前和排斥后；
IL-1rα治疗组术后各时间段房水中IL-1β含量明显低于生理盐水对照组
Fas，FasL蛋白水平
各实验组Fas，FasL蛋白的表达在急性排斥期程度最高，明显高于排斥前和排斥后。
在角膜移植排斥反应的各时期，IL-1rα治疗组Fas和FasL蛋白的表达水平均明显低于生理盐水对照组, 且存在剂量相关性。
讨论：
白细胞介素-1β（IL-1β）与角膜移植免疫
白细胞介素-1β（IL-1β）简介
机体内作用最强的炎症细胞因子；参与炎症细胞和免疫细胞的分化和作用发挥；主要生物学效应由IL-1β介导 。
IL-1β参与角膜移植排斥反应中细胞免疫过程
角膜移植免疫排斥反应以T淋巴细胞介导的细胞免疫为主；IL-1β是重要的前炎症细胞因子，刺激其他炎性细胞因子IL-6，IL-8的产生，介导细胞毒T淋巴细胞，中性粒细胞，巨噬细胞进入前房，加重对角膜移植物的炎性浸润，加剧角膜移植免疫排斥反应的发生和发展 。
IL-1β与角膜移植免疫排斥中细胞凋亡的发生
IL-1β是一种细胞凋亡调节因子，诱导角膜移植排斥反应中细胞凋亡发生的可能机制：
直接作用：上皮细胞，浸润的T淋巴细胞和巨噬细胞分泌IL-1，与基质细胞表面的IL-1受体相结合---------基质细胞凋亡
间接作用：
IL-1刺激角膜基质细胞表达FasL蛋白，与基质细胞Fas结合----基质细胞凋亡；
创伤上皮可分泌可溶性FasL（sFasL），与角膜上皮细胞本身存在的Fas结合------上皮细胞凋亡；
sFasL以游离形式进入角膜基质，与基质细胞Fas结合----------基质细胞凋亡；
本研究结果提示：
在角膜移植免疫排斥反应前房水中IL-1β含量已经达到较高水平，说明IL-1β符合炎性前因子的观点 ；急性排斥期IL-1β含量明显上升，说明其作为重要的免疫效应因子在移植免疫排斥反应中发挥重要的作用。
白细胞介素1受体拮抗剂（IL-1ra）与角膜移植排斥反应
选择IL-1ra作为干预因素的原因
1.生物学作用：是天然存在的IL-1的异构体，能够竞争性地与IL-1受体结合，阻断IL-1的生物学效应。
2.是一种免疫活性物质，生物学活性和使用剂量有直线相关性，利于实验研究。
3.毒副作用小，具有良好的临床应用前景。
本研究结果提示：
IL-1ra可通过阻断IL-1的生物学活性发挥免疫抑制作用，其作用过程可能有细胞凋亡机制的参与：
途径1：在角膜移植排斥反应中CTL对靶细胞的杀伤作用通过细胞凋亡途径实现，IL-1是激活CTL的关键因子。IL-1ra可抑制CTL的激活及其细胞表面FasL的表达，减少移植物细胞凋亡，减轻角膜免疫排斥反应引起的植片损害。
途径2：角膜创伤上皮可分泌IL-1β，后者刺激角膜基质细胞表达FasL蛋白，介导基质细胞凋亡，IL-1ra通过抑制IL-1β的生物学活性，减少角膜基质细胞FasL蛋白的表达和角膜基质细胞凋亡的发生。
临床治疗意义
目前已有学者应用IL-1ra治疗移植物抗宿主反应并取得良好效果。
IL-1ra可能通过抑制细胞凋亡途径发挥免疫抑制作用 ，成为近年来研究的热点，其临床应用的范围有望扩展。
全文结论
本实验研究结果总结
1. 角膜移植术后早期即出现基质细胞凋亡，与角膜局部创伤修复有关；
2. 在IL-1β等细胞因子的共同作用下，Fas/FasL介导的caspase依赖性的细胞凋亡参与角膜移植排斥免疫反应的发生。
3. IL-1受体拮抗剂可能通过细胞凋亡途径发挥免疫抑制作用
本实验研究意义
1. 进一步阐明角膜移植免疫排斥反应的免疫学发生机制；
2. 为临床防治免疫排斥反应的发生提供崭新的途径。
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