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| 人眼脉络膜微血管内皮细胞的培养及内皮抑素抑制其增殖的实验研究 |
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作者：张明 张军… 文章来源：四川大学华西眼科中心 610041 点击数：1313 更新时间：2004/5/28 
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| 目的：脉络膜新生血管的发生是一系列引起视功能严重障碍的脉络膜、视网膜疾病的重要病理生物学机制，尤其在渗出性老年性黄斑变性，脉络膜新生血管是致盲的根本原因。虽然临床诊断不难，但是它的发病机制目前仍不清楚，而且尚无有效的治疗药物。脉络膜新生血管是脉络膜的异常血管发生与血管生成，在这个过程中，脉络膜微血管内皮细胞的病变起重要的作用。当血管新生因子与抑制因子间的平衡被破坏，血管内皮细胞发生增殖、迁移和异常的细胞因子分泌，这些在新生血管的形成、演变、消退中起着决定性的作用。内皮抑素能特异性地抑制血管内皮细胞的增殖。由于脉络膜组织成分的复杂和特殊，脉络膜微血管内皮细胞的纯化培养是很困难的。本研究通过组织块酶消化的方法联合免疫磁珠的纯化技术建立人眼脉络膜微血管内皮细胞的培养方法，提供体外研究的模型，进一步地探讨内皮抑素抑制人眼脉络膜微血管内皮细胞增殖的作用，为防治脉络膜新生血管提供科学依据。
方法：
1.人眼脉络膜组织块胰酶、胶原酶两步酶消化法联合CD31Dynabeads纯化技术分选人眼脉络膜微血管内皮细胞行细胞培养；
2.培养的人眼脉络膜微血管内皮细胞的倒置相差显微镜形态学观察；
3.培养人眼脉络膜微血管内皮细胞透射电子显微镜超微结构的观察；
4.免疫组织化学染色检测人眼脉络膜微血管内皮细胞FⅧ因子相关抗原、CD31、CD34，单个人眼脉络膜微血管内皮细胞平均面积和平均直径的测定；
5.MTT法人眼脉络膜微血管内皮细胞生长曲线的测定；
6.MTT法观察内皮抑素对培养的人眼脉络膜微血管内皮细胞增殖的抑制作用；
结果：
1.消化、纯化后可获得足够量的人眼脉络膜微血管内皮细胞，细胞聚集成簇；
2.原代培养的细胞开始呈细长的形状，成片生长的细胞呈多边形、类圆形，细胞群融合后呈铺路石样外观，约2~3周细胞长满培养瓶底面，可见接触抑制现象；1：2传代培养次日常可见有较多的内皮细胞死亡，细胞保持圆形或多边形，融合成单层时呈鹅卵石样排列，传代后约1周细胞可长满培养瓶底面需再次传代。
3.透射电镜下可见人眼脉络膜微血管内皮细胞具有血管内皮细胞特征性的Weibel-Palade小体；
4.培养的人眼脉络膜微血管内皮细胞经FⅧ因子相关抗原、CD31、CD34免疫组织化学染色95%以上的细胞呈阳性反应——棕褐色着色，阴性对照未见着色，单个人眼脉络膜微血管内皮细胞的平均面积为：2254.37±155.94um2/个，平均直径为：53.94±1.88um/个；
5.人眼脉络膜微血管内皮细胞生长曲线显示：在传代后第一天细胞增殖不明显,经过2～3天的潜伏期后进入对数生长期,约在第5天进入平台期并持续至第8天,到第9天细胞出现生长抑制；
6.一定浓度的ES作用下可见人眼脉络膜微血管内皮细胞的增殖受到抑制，ES有效作用浓度≥1250ng/ml，浓度愈高抑制作用愈明显，尤其对VEGF诱导的人眼脉络膜微血管内皮细胞的增殖，与对照组相比差异具有显著性，（P<0.05）；VEGF可刺激人眼脉络膜微血管内皮细胞增殖，与无血清对照组相比较具有统计学意义（P<0.05）；内皮抑素在早期即有抑制VEGF诱导的人眼脉络膜微血管内皮细胞增殖，与对照组相比有统计学差异（P<0.05），但是，一次给予内皮抑素作用维持时间不超过72小时。
结论：
本实验研究在国内首次成功地进行了人眼脉络膜微血管内皮细胞培养，纯度较高，方法易行，可获得足够实验研究的细胞数量；并证实内皮抑素对人眼脉络膜微血管内皮细胞增殖有抑制作用，尤其是VEGF诱导的人眼脉络膜微血管内皮细胞增殖。内皮抑素有可能在防治脉络膜新生血管中开阔一个新途径。 |
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| 会议投稿录入：毛进 责任编辑：毛进 |
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