| 目的 构建人色素上皮源性因子(PEDF) 基因真核表达载体，并观察其在大鼠眼内的表达。方法 构建pcPEDF 重组质粒，将PEDF 基因克隆到真核表达载体PcDNA3.0 中，质粒pGEM-T-PEDF和PcDNA3.0分别用EcoR I和Not I进行切割, 各自回收纯化后,再用T4DNA连接酶将两者连接。将PEDF片断连接到pcDNA 3.0 中, CaCl2 转化法制备感受态菌DH5a，将重组后的质粒转化至大肠杆菌DH5a中, 通过蓝白筛选,挑取白色克隆以载体引物进行菌液PCR方法鉴定。按质粒提取试剂盒说明提取质粒,双酶切鉴定并测序。阳离子脂质体介导pcPEDF在大鼠眼内的表达， SD 大鼠按每公斤体重腹腔注射1 %戊巴比妥钠30 mg 麻醉,1 %丁卡因眼液滴眼。手术显微镜直视下先剪开右眼球结膜,于睫状体平坦部垂直刺入微量进样器,并尽量将针头接近对侧视网膜表面,注入15 μl 脂质体-DNA 混合物(将1.5μg质粒DNA 溶于7.5μl NS 中,再加7.5μl 脂质体混匀,静置30 min) 到SD大鼠玻璃体腔内，左眼不注射作为阴性对照。分别于术后1、2、3、4 周时取出眼球, 应用免疫组化方法进行检测。结果 测序鉴定、酶切及琼脂糖电泳分析pcPEDF 中含有PEDF 基因，用免疫组化方法检测证实PEDF在大鼠视网膜神经细胞中表达。结论 成功的构建了含有人色素上皮源性因子基因的真核表达载体,并能持续、稳定地在大鼠视网膜神经细胞中表达。 |
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