| 目的: 应用分子生物学技术克隆大鼠生长相关蛋白（rat growth associated protein-43，rGAP-43）的基因片段,并以腺相关病毒（adeno-associated virus vector ，AAV）为载体构建出rGAP-43的表达系统，为进一步研究rGAP-43对大鼠视网膜中各类细胞的作用奠定基础，也为下一步进行基因治疗的研究提供实验依据。
方法: 1.经RT-PCR法,获得SD大鼠脑组织的cDNA文库，设计引物，从中扩增出GAP-43基因的开放读码框区（open reading frame，ORF）基因片段,克隆入T载体,经DNA序列测定正确后，再大量扩增rGAP-43基因片段。
2.同时将报告基因—绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein ，EGFP）经SalⅠ/BglⅡ酶切后连接上经同样酶切AAV-MCS多克隆载体，重组命名为AAV-EGFP,进行酶切鉴定与DNA序列测定。
3.将目的基因rGAP-43经BamHⅠ/SalⅠ酶切后连接上经同样酶切的含EGFP报告基因的AAV质粒载体（AAV-EGFP）。重组表达质粒命名为AAV-EGFP-rGAP-43，随后针对重组表达质粒AAV-EGFP-rGAP-43进行酶切、DNA序列测定等结构上的鉴定。
4.将重组表达质粒及AAV转染需要的辅助质粒pHelper、pAAV-RC经脂质体共转染入培养好的AAV-293细胞，进行荧光表达的检测以及病毒的包装、病毒原液的收集及病毒感染性滴度的测定等。
结果:. 1.克隆出的rGAP-43基因的ORF区片段以及构建的AAV-EGFP-rGAP-43重组表达质粒，两者经DNA序列测定，所测序列与GeneBank检索的完全一致。
. 2.重组表达质粒转染后的AAV-293细胞可检测到报告基因绿色荧光的表达，根据表达荧光的细胞数得到重组病毒的感染性滴度为106 particles/ml。
结论: 1.应用分子生物学方法可以成功地克隆大鼠GAP-43基因并构建以腺相关病毒为载体、可表达绿色荧光的rGAP-43重组质粒。
. 2.构建的重组质粒能够顺利地进行病毒的包装。因此可以进一步地应用表达质粒通过病毒介导基因转移的方法来进一步地研究rGAP-43在大鼠视网膜、视神经中所起的作用
|
网友评论：（只显示最新10条。评论内容只代表网友观点，与本站立场无关！）