| 目的 克隆视网膜特异性启动子Rho启动子，构建真核表达载体PcDNA3.1+-Rho-VEGF,初步构建视网膜特异Rho-VEGF转基因鼠
方法 用PCR方法从BALB/c小鼠全基因组扩增能在视网膜组织特异性表达的Rho启动子，酶切纯化后克隆于质粒PcDNA3.1＋-VEGF中，建立重组质粒pcDNA3.1＋-Rho-VEGF,通过限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒pcDNA3.1＋-Rho-VEGF,最终结果通过测序鉴定。由jPetI介导转染人视网膜色素上皮细胞（D407细胞）和人脐静脉内皮细胞（ECV-304细胞），通过绘制细胞生长曲线和免疫组织化学的方法观察所构建的Rho启动子的视网膜特异性表达作用。利用NheI,XmnI双酶切获得Rho-VEGF-Poly(A)片断，利用雄原核注射法初步建立Rho-VEGF转基因鼠，PCR检测获取阳性转基因鼠。结果克隆视网膜特异性启动子Rho启动子，构建了在视网膜特异性表达的VEGF基因的重组真核表达载体，并在人视网膜色素上皮细胞和人脐静脉内皮细胞中表达出VEGF蛋白;经PCR检测，共获得5只Rho-VEGF转基因PCR阳性鼠。结论 Rho启动子可使外源性VEGF基因在视网膜色素上皮细胞（D407细胞）中特异性表达。初步获的视网膜特异性Rho-VEGF转基因鼠，为进一步研究VEGF在视网膜新生血管形成中的致病机理以及糖尿病视网膜病变的基因治疗提供基础材料。 |
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