pcDNA3.1/myc-His(-)mMYOC质粒的构建及在COS-7细胞中的表达
王建文 刘建巨
（哈尔滨医科大学附属第一医院眼科，黑龙江 哈尔滨 150001）
〔摘要〕目的 构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)mMYOC，并在COS-7细胞中表达以研究Pro370Leu突变型蛋白的特点。方法 以pGEM-T-MYOC质粒中MYOC为模板，用PCR介导的定点突变技术，得到Pro370Leu突变型MYOC基因（mMYOC），并定向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B上，得到pcDNA3.1/myc-His(-)mMYOC重组表达质粒，用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定，用脂质体法转染COS-7细胞，用特异性引物对转染的COS-7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,用抗标签基因His表达产物的特异性抗体,进行Western blot法检测蛋白分泌情况，流式细胞义检测凋亡。结果 证实重组质粒构建成功，mMYOC基因能在COS-7细胞中表达,并且mMYOC蛋白不能分泌到培养液中和促进细胞凋亡作用。结论 成功构建真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)mMYOC，并能有效表达，但是蛋白表现分泌障碍并能促进凋亡。
〔关键词〕 基因MYOC；凋亡；重组质粒；青光眼
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