实验目的 维持渗透压稳定对于保持晶状体透明性有重要意义。渗透压反应元件结合蛋白(osmotic response element binding protein,OREBP)在多种细胞、组织中有表达,是调节渗透压的重要调节蛋白。不同细胞在高渗条件下,OREBP mRNA水平表达量增高不同。OREBP通过促进小分子渗透压物质的合成与利用,从而保持细胞内渗透压稳定。OREBP调控HSP70等其他非渗透压相关基因,并在高渗刺激下促进他们表达。OREBP的调节功能异常,可表现为晶状体混浊的形成。目前的研究普遍认为晶状体上皮细胞的凋亡与白内障的发生有重要关系,渗透压也是诱导细胞凋亡的重要因素。本实验拟研究高渗条件下,晶状体上皮细胞OREBP mRNA表达水平及其活性变化;与超显性活性抑制ORBEP后,对晶状体上皮细胞的细胞活性及对细胞凋亡的影响。
实验方法 高渗培养液处理人晶状体上皮细胞系。按照是否加入高渗培养液分为高渗组和等渗组。利用Real-Time PCR方法半定量分析不同渗透压条件下,OREBP mRNA的表达量,及用RT-PCR 方法半定量分析不同渗透压条件下HSP70表达量,以反映OREBP活性变化。转染DN-OREBP超表达显性抑制OREBP后,RT-PCR 方法半定量分析不同渗透压条件想HSP70表达量反映OREBP活性变化,及检测利用Annexin V-PE法检测细胞凋亡率。
实验结果 高渗培养液处理后,OREBP mRNA表达量增加,及HSP70表达量增加。转染DN-OREBP后,在高渗条件下,HSP70表达量增加,等渗条件下没变化。且转染DN-OREBP组细胞凋亡率较空白对照组增加。
实验结论 晶状体上皮细胞中高渗引起的OREBP mRNA表达水平较等渗增高。高渗不仅引起ORBEP表达量增高 ,其活性也增强。OREBP在高渗是活性增加,等渗条件下,无明显变化。OREBP对于晶状体上皮细胞抵抗渗透压所致损伤有保护作用。 |