目的 体外培养并筛选生物学特性接近生理状态的兔角膜内皮细胞，以同种及异种（猪）去细胞后弹力层组织为载体构建组织工程角膜内皮细胞膜片并对其进行评价。
方法 完整撕除兔角膜后弹力层，胰蛋白酶消化法原代培养角膜内皮细胞（CECs），分别从形态学、基因水平和蛋白质水平鉴定细胞：茜素红染色观察细胞形态，与新鲜角膜角膜组织的CECs进行对比；RT-PCR法检测IVα2型胶原(COL4A2)、血管内皮生长因子受体2（FLK1）、Na+-K+ATP酶(ATP1A1)、水通道蛋白1（AQP1）、电压依从性阴离子通道（VDACs）等相对特异性基因；免疫细胞化学法观察神经元特异性烯醇化酶（NSE）、Na+-K+ATP酶及紧密连接蛋白ZO-1的表达。采用MTT比色法测定传代后CECs的增殖活性变化，采用超微量ATP酶试剂盒及免疫荧光法分别测定传代后细胞Na+-K+ATP酶活性及其表达量的变化，以筛选状态最佳的种子细胞。中性蛋白酶消化并刮除同种（兔）及异种（猪）角膜内皮细胞后，以其后弹力层组织为载体，分别接种CECs，光镜下观察细胞的生长状态。以新鲜角膜组织为对照，HE染色及茜素红染色观察细胞形态，扫描电镜观察细胞间连接的形成情况，透射电镜观察细胞超微结构及其与载体的贴附情况。Live/Dead荧光探针检测膜片上细胞的活性。免疫荧光法检测膜片上细胞Na+-K+ATP酶等功能蛋白的表达情况。
结果 原代培养的兔CECs多在24 h内贴壁，2~3 d达融合，形态呈六边形。随着传代代数的增加，细胞形态逐渐发生改变，第2代、第3代细胞可见空泡样变。原代培养的细胞茜素红染色可见清晰的细胞轮廓，与在体的CECs形态相似。RT-PCR检测到COL4A2、FLK1、ATP1A1、AQP1、VDACs等基因在培养细胞中的表达。免疫荧光染色结果显示NSE、Na+-K+-ATP酶、ZO-1在培养细胞中呈阳性表达。MTT结果显示传代后细胞增生活性逐渐下降，尤其第2、第3代细胞下降明显。定量检测结果显示随着传代代数的增加，兔CECs的Na+-K+ATP酶活性逐渐降低，各代细胞的Na+-K+ATP酶活性总体比较差异有统计学意义（F=77.174, P=0.000）。以同/异种后弹力层为载体构建细胞膜片后，HE染色可见形成单层细胞，茜素红染色可见其形态类似六边形，电镜结果显示细胞间形成紧密连接，细胞与DM紧密贴附。荧光探针示细胞活性良好，可见Na+-K+-ATP酶的阳性表达。
结论 经生物学特性检测，原代培养的CECs最适宜作为组织工程种子细胞；以同/异种后弹力层组织为载体构建细胞膜片后，经形态、功能及超微结构检测，均与新鲜角膜组织类似。 | 
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