诱导视网膜母细胞瘤细胞分化为视网膜神经节细胞的研究

方法 1. 体外培养RB基因纯合缺失的视网膜母细胞瘤细胞系WERI-RB1，行Hoechst33342荧光染色，维拉帕米拮抗对照，应用流式细胞仪UV荧光激活细胞分选法检测其侧群（SP）细胞比例；应用流式细胞仪检测法分析WERI-RB1中肿瘤干细胞标记物CD133的表达情况，确定肿瘤干细胞比例，使用含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及表皮生长因子(EGF)的无血清化学限定培养基（SFM）对WERI-RB1中的肿瘤干细胞进行分离培养。2. RB肿瘤干细胞特性鉴定：使用有限稀释法检测RB肿瘤干细胞的单细胞克隆形成能力，绘制RB肿瘤干细胞的生长曲线，RT-PCR检测RB肿瘤干细胞中Nanog、Oct3/4、Musashi-1等干细胞相关基因的表达，细胞免疫荧光法检测干细胞相关蛋白的表达，NOD/SCID 裸鼠皮下注射检测干细胞体内成瘤能力。3. RB视网膜前体细胞特性鉴定：RT-PCR检测WERI-RB1中神经或视网膜早期发育相关基因Chx、Pax6、 Rx、 Nestin、 CD133及 Lhx2的表达，细胞免疫荧光发检测相关蛋白表达。4. 细胞因子法诱导RB干细胞向视网膜神经节细胞分化：培养液中添加诱导因子Dkk1、Lefty A、Noggin诱导RB细胞分化为视网膜神经节细胞，RT-PCR及免疫荧光检测诱导前后视网膜神经节细胞相关基因及蛋白的表达情况。
结果 1. RB细胞系WERI-RB1中存在比例相对稳定的侧群细胞，SP细胞比例为0.075±0.017%。应用SFM法分离培养前后WERI-RB1中CD133的比例为45.9% 及99.03±0.09%。2. SFM法分离培养后细胞克隆形成能力、体外增殖能力及NOD/SCID裸鼠皮下成瘤能力明显高于分离培养前，RB细胞表达干细胞相关标记物Nanog、Oct3/4、Musashi-1的基因及蛋白。3. RB细胞表达神经或视网膜早期发育相关基因及蛋白Chx、Pax6、 Rx、 Nestin、 CD133及 Lhx2，具备视网膜前体细胞特性。4. 诱导因子Dkk1、Lefty A、Noggin可诱导RB细胞向视网膜神经节细胞分化，表达视网膜神经节细胞相关基因及蛋白。
结论视网膜母细胞瘤细胞系WERI-RB1具有肿瘤干细胞特性及视网膜前体细胞特性，在一定诱导因子作用下，可定向分化为视网膜神经节细胞，下一步研究将通过改变细胞表观遗传学决定簇，去除其成瘤性，从而为干细胞替代治疗的种子细胞来源提供新的解决方案。