目的 研究Cx46G2N突变对晶状体中hemichannel功能的影响，揭示其引起先天性白内障的机制。
方法 将表达野生型Cx46(wtCx46)和Cx46G2N基因的cDNA克隆致真核表达载体pEGFPN1。瞬时转染HeLa细胞48小时后，利用hemichannel功能调节受Ca2+浓度影响的原理，分别向无Ca2+、含有1.2mmol/L Ca2+、含有300umol/L 氟芬那酸 ( FFA)的HBSS 溶液中添加荧光核燃料0.1%4,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI，电荷+2，分子量350 ）或0.1%溴化丙啶（PI，电荷+2，分子量650）。将两组细胞置于各种溶液中，利用荧光显微镜观察不同分子量染料进入细胞的比例及时间梯度过程，经计数和统计分析后，推测hemichannel的启闭状态，进一步分析基因突变对Cx46 hemihannel的功能影响。
结果 在无Ca2+HBSS溶液中，wtCx46 hemichannel处于全开放状态，细胞可于十分钟内摄入0.1% DAPI，且染色细胞比例始终维持在高水平（>90%)；0.1%PI也可被开放的wtCx46 hemichannel摄入，随时间延长，染色细胞比例逐渐增高，至1h时，达到96.6%。 加入hemichannel阻滞剂（1.2mmol/L Ca2+、300umol/L FFA)后，wtCx46 hemichannel关闭，转染细胞的染料摄入明显减少，说明wtCx46 hemichannel处于正常功能状态。Cx46G2N转染细胞hemichannel在全开放状态下（无Ca2+HBSS溶液中），摄入DAPI的能力与wtCx46相比差异无统计学意义；而其对PI的摄取能力，在10min、30min、60min的时间点均明显低于wtCx46组（0 vs 36.2%; 12.9% vs91.2%; 29.2 vs 96.6)。
结论 Cx46G2N突变蛋白与wtCx46相比，组成hemichannel孔径变小，对大分子量物质的通透性明显降低，提示Cx46蛋白第二位甘氨酸在hemichannel正常功能中承担重要作用。本研究在国内首次使用染色法对hemichannel功能进行评定，同时对Cx46G2N突变致先天性白内障机制进行了探讨，为缝隙连接蛋白N端氨基酸在晶状体生理状态维持中的作用研究提供了新的思路。 |
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