目的 通过siRNA抑制POK红系髓性致癌因子(POK erythroid myeloid Ontogenic factor,pokemon)基因的表达,观察其对视网膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelial,RPE)细胞增殖和吞噬的影响。
方法 采用人RPE(细胞系D407)细胞作为研究对象,化学合成pokemon特异的siRNA,利用Lipofectamine 2000将siRNA转染到培养的RPE细胞中,通过RT-PCR,western-blotting来检测siRNA对pokemon基因表达的抑制效率和对脂肪酸合成酶(FASN)的表达的影响,相差显微镜观察细胞的生长形态,细胞计数板对细胞进行计数,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,荧光显微镜观察siRNA转染对荧光颗粒的吞噬效率。
结果 western-blotting实验发现在培养的人RPE细胞系中pokemon基因存在高表达的现象。转染pokemon特异siRNA后,pokemon基因在RPE细胞中的表达受到抑制,RT-PCR显示转染siRNA组与非转染siRNA组相比抑制率为60%,western-blotting检测蛋白的表达降低;相差显微镜可以观察到RPE细胞的生长形态发生了明显变化;细胞计数显示细胞的增值受到了明显抑制,转染第4天,转染组的细胞数仅有非转染组的65%;siRNA转染后,细胞没有发生凋亡现象;荧光显微镜观察显示转染siRNA组的荧光颗粒的亮度弱于对照组;RT-PCR可以检测到FASN的表达下调。
结论 siRNA抑制pokemon基因的表达,能够明显的抑制RPE细胞的增殖,降低对荧光颗粒的吞噬效率。 |