目的 验证氧化应激对线粒体DNA所造成损伤的持续积累是导致人角膜内皮细胞缺乏增殖能力的原因之一。
方法 收集不同年龄的行穿透性角膜移植术后供体的角膜环组织，撕取后弹力层，提取总RNA并反转录为cDNA，行反转录PCR检测26个与氧化应激相关的基因表达；BrdU染色检测细胞增殖；Western Blot检测ERK1/2、JNK/SAPK、p38 MAPK信号通路的激活。体外传代培养人和牛的角膜内皮细胞。β-半乳糖苷酶检测细胞衰老程度；BrdU染色检验细胞增殖；DCFH-DA检测细胞内ROS的累积；Mito Tracker 标记线粒体，MitoSOX Red检测线粒体内超氧化物的累积。
结果 反转录PCR结果显示抗氧化相关的基因表达显著低于氧化物生成相关基因的表达，表明随年龄增长人角膜内皮细胞存在抗氧化物和氧化物生成系统之间的不平衡且细胞增殖活性下降。Western Blot结果表明随年龄增长JNK/SAPK与p38 MAPK通路激活。体外培养的人角膜内皮细胞P4代时，与传40代的牛角膜内皮细胞相比，β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数量显著增加，表明人角膜内皮细胞体外过早衰老。BrdU染色结果表明人角膜内皮细胞的增殖能力低于牛角膜内皮细胞。DCFH-DA染色结果表明大量ROS累积于体外培养的P4代人角膜内皮细胞内；通过Mito Tracker 与MitoSOX Red染色发现大量超氧化物累积于体外培养的P4代人角膜内皮细胞线粒体内。
结论 与牛角膜内皮细胞相比，氧化应激所导致的线粒体DNA损伤的积累诱导人角膜内皮细胞过早衰老，可能是人角膜内皮细胞缺乏增殖能力的原因之一。 | 
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